PROVA D'OXIDASA: FONAMENT, PROCEDIMENT I USOS - BIOLOGIA - 2025

La prova d'oxidasa és un mètode diagnòstic que evidencia la presència de el complex enzimàtic anomenat citocrom oxidasa c. Aquest sistema indueix la transformació de citocrom reduït a oxidat, ja que capta l'oxigen i aquest al seu torn actua com a últim acceptor d'electrons (H ⁺) a la cadena respiratòria.

El terme oxidasa és una forma resumida de fer referència a l'enzim citocrom oxidasa, també coneguda com indofenol oxidasa. En l'antiguitat es va creure que els enzims citocrom oxidasa i la indofenol oxidasa eren dos enzims diferents, però avui se sap que són la mateixa.

Prova d'oxidasa Positiva i Negativa. Font: No machine-readable Autor provided. Alpha.prim ~ commonswiki assumed (based on copyright claims).

Per la seva banda, els citocroms són hemoproteínas que contenen ferro i completen el sistema citocrom oxidasa. Els citocroms poden variar d'una espècie a una altra.

Existeixen diferents varietats de citocroms (citocroms a1, a2, a3 i 0). Alguns bacteris poden produir una sola, però altres fins a dos o tres alhora. En aquest sentit, la presència de citocrom ai a3 es coneix com citocrom - oxidasa c. Aquest és el tipus de citocrom que detecta la prova de oxidasa.

Els gèneres Neisseria i Pseudomonas contenen citocrom oxidasa c. Aquests gèneres donen la prova de oxidasa positiva, ajudant a diferenciar-los dels gèneres Acinetobacter i Stenotrophomonas respectivament.

També hi ha altres gèneres que són oxidasa positius.

fonament

Característiques de sistema citocrom oxidasa c

El sistema citocrom oxidasa c actua de la següent manera: els microorganismes oxidasa positius utilitzen l'oxigen per generar energia a través de la respiració aeròbica. Aquest sistema funciona gràcies a el transport d'electrons a partir de substàncies donadores com el NADH ⁺ cap a substàncies receptores, en aquest cas l'oxigen.

Això dóna com a resultat que es produeixi energia (ATP) i aigua o peròxid d'hidrogen, depenent de el sistema de citocrom oxidasa que tingui el microorganisme.

És per això que la majoria dels bacteris oxidasa positius també són catalasa positives, condició necessària per eliminar el peròxid d'hidrogen produït, ja que aquesta substància és tòxica per als bacteris.

El sistema citocrom oxidasa c és present en alguns bacteris aerobis, certes anaeròbies facultatives, escasses microaerofílicas i cap anaeròbia estricta. Això últim és comprensible, ja que els anaerobis estrictes no poden viure en presència de l'oxigen, per tant no tenen el sistema citocrom oxidasa.

Principi de la prova

En aquesta prova utilitza substàncies que actuen com acceptors artificials d'electrons, substituint els naturals dins de la cadena de transport d'electrons.

Principalment s'utilitzen colorants com el parafenilendiamina i el indofenol, que actuen com a substrats receptors i donadors d'electrons artificials.

El parafenilendiamina és oxidat pel sistema de citocrom oxidasa c. El colorant en la seva forma reduïda és incolora, però en la seva forma oxidada és acolorit.

És així com es posa en evidència la presència de sistema citocrom oxidasa c; doncs una reacció positiva generarà una coloració espígol o blau -púrpura depenent de l'reactiu utilitzat.

En canvi, si l'última substància acceptora d'electrons en la cadena respiratòria és diferent a l'oxigen, la prova de oxidasa donarà negativa (no hi ha producció de color); aquest és el cas dels microorganismes anaerobis.

Així mateix, si el citocrom utilitzat pel microorganisme és diferent a citocrom oxidasa c, també donarà la prova negativa.

procediment

Per a la prova de l'oxidasa ha diversos reactius i protocols, tots amb la mateixa finalitat.

reactius

Reactiu de Kovacs, reactiu de Gordon i McLeod, reactiu de Nadi, reactiu de Carpenter, Suhrland i Morrison, i ús de discos de oxidasa.

-Reactivo de oxidasa de Kovacs

Està format per diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina a l'1%.

El reactiu de Kovacs es prepara dissolent 1 g de la substància abans esmentada en 50 ml d'aigua destil·lada. S'escalfa subtilment fins a la seva dissolució total. Transvasar a un flascó color ambre de capacitat suficient i completar el volum a 100 ml amb aigua destil·lada. Esperar el menys 15 minuts abans d'utilitzar. Desar en nevera protegit de la llum.

Es retola com a reactiu de oxidasa de Kovacs, per diferenciar-ho de l'reactiu de Kovacs utilitzat per revelar la prova de l'indol. Aquest reactiu és el més sensible, menys tòxic però més costós que la resta dels reactius.

Una reacció positiva s'evidenciarà amb aquest reactiu amb el canvi de color de la colònia de lavanda, que vira ràpidament a porpra gairebé negre. Una reacció negativa s'evidencia perquè no hi ha canvi de color de la colònia o aquesta pren una lleugera coloració rosada. El medi pot igualment se fosc, però això no vol dir reacció positiva.

Amb aquest reactiu el temps de reacció és crucial, es considera una reacció positiva aquell canvi de color que passa entre 5 a 15 seg.

-Reactivo de Gordon i McLeod

Està compost per diclorhidrato de dimetil-p-fenilendiamina, també conegut com a N-dimetil-p-fenilendiamina o monoclorhidrato de p-aminodimetilanilina. Es prepara com va ser descrit per al reactiu de oxidasa de Kovacs, substituint per la substància involucrada.

Aquest reactiu és lleugerament més estable que el reactiu de oxidasa de Kovacs, encara que tots els reactius que contenen p-fenilendiamina són inestables.

Aquesta reacció és més tardana, s'interpreta com a positiva amb l'aparició d'un color blau -púrpura dins de 10 a 30 minuts.

-Reactivo de Nadi

Està compost per α-naftol a l'1% en alcohol etílic (etanol a l'95%) i 1% de aminodimetilanilina. La barreja es prepara a parts iguals i utilitzant alcohol etílic absolut com diluente, fins a completar la quantitat suficient per a 100 ml.

-Reactivo de Carpenter, Suhrland i Morrison

Està compost per oxalat de p-aminodimetilalanina a l'1%. Preparar de la mateixa manera a la descrita per reactiu de oxidasa de Kovacs, canviant per la substància corresponent.

Amb la solució llista, es preparen tires reactives de la següent manera: s'impregnen tires de paper de filtre Whatman N ° 1 de 6-8 cm amb el reactiu d'oxalat de dimetil-p-fenilendiamina a l'1%.

Es deixen assecar sense que tingui contacte amb metall, guardar en flascons tapa de rosca amb dessecant i conservar en nevera. Aquestes tires són estables fins per 6 mesos.

És el reactiu més estable de tots els esmentats, podent durar en solució fins a 6 mesos. Un altre punt a favor és que no acoloreix el medi al voltant de la colònia, si s'usa directe sobre la placa.

L'aparició d'un color vermell s'interpreta com una prova positiva.

-Discos de oxidasa

Són discos comercials que vénen impregnats amb reactiu per a la prova d'oxidasa. Hi ha diverses marques comercials en el mercat.

El seu ús és bastant pràctic, ja que no cal preparar reactius frescos, cosa que facilita la feina. Els resultats obtinguts són fiables sempre que els discos es conservin adequadament.

protocols

Mètode en placa directa, mètode indirecte sobre paper i ús de discos impregnats amb reactius de oxidasa.

-Mètode de la placa directa

S'afegeixen 2 o 3 gotes de qualsevol dels reactius abans esmentats per a aquest fi directament sobre la o les colònia (s) contingudes en una placa de medi de cultiu que no contingui glucosa.

S'interpreta el canvi o no de color de les colònies, no d'el medi. El temps de reacció vàlid depèn de l'reactiu utilitzat.

-Mètode indirecte sobre paper

Tallar un tros de paper de filtre (Whatman N ° 1) a una mida de 6 cm ² i es col·loca dins d'una placa de Petri buida.

Addicionar 2 o 3 gotes de el reactiu de oxidasa de Kovacs en el paper, prendre part de la colònia que es vol estudiar amb una nansa de platí o escuradents de fusta i estendre-la en línia recta sobre el paper impregnat de reactiu. Interpretar en un lapse de 5 a 10 segons.

Amb les tires preparades amb el reactiu Carpenter, Suhrland i Morrison s'estén una colònia sobre la tira seca. Una mateixa tira serveix per provar diversos ceps. Interpretar en 10 seg.

-Discos (m

Humitejar subtilment els discos comercials amb aigua destil·lada estèril i sobreposar sobre la colònia a estudiar. Es recomana usar les plaques a 35 ° C, si s'usen plaques a temperatura ambient o plaques refrigerades la reacció és una mica més lenta. Interpretar el canvi de color entre 10 a 20 seg.

Es poden usar colònies contingudes en agar sang o xocolata.

-Discos (mètode indirecte)

Humitejar el disc com es va descriure anteriorment. Col · locar en una placa de Petri buida. Prendre quantitat suficient de la colònia a estudiar amb una nansa de platí o escuradents de fusta i col·locar sobre el disc. Interpretar el canvi de color entre 10 a 20 seg.

ús

El gènere Neisseria i Acinetobacter en ocasions s'assemblen molt morfològicament perquè tot i que el gènere Acinetobacter és un bacil Gram negatiu, de vegades pot adoptar una forma cocoide i distribuir-se en parells, simulant el gènere Neisseria.

En aquest cas la prova de oxidasa és realment útil. El gènere Neisseria és positiva i Acinetobacter negativa.

No obstant això, el gènere Moraxella és molt similar a l'gènere Neisseria i ambdues donen reacció positiva; és per això que sempre cal realitzar proves de fermentació de carbohidrats per a la identificació definitiva.

D'altra banda, la prova de oxidasa és útil per diferenciar un bacteri que pertany a la família Enterobacteriaceae (tots oxidasa negativa) d'altres fermentadors, com ara el gènere Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oxidasa positius).

El gènere Vibrio i Helicobacter també són oxidasa positius.

Control de qualitat

Utilitza soques conegudes d'Escherichia coli com a control negatiu i soques de Pseudomonas aeruginosa com a control positiu.

limitacions

-Els reactius han d'usar-acabats de fer, la seva vida útil en solució a temperatura ambient és curta per ser molt inestables. Refrigerats poden durar entre 5 dies a 2 setmanes.

-Els reactius són incolors, si canvien de color han de ser rebutjats. Els discos danyats s'evidencien perquè s'enfosqueixen amb el temps.

-Una reacció positiva amb el reactiu oxidasa de Kovacs entre 15 -60 segons es considera una reacció retardada i després de passar 60 segons s'ha de considerar com a negativa.

-El Haemophylus influenzae dóna una reacció oxidasa negativa si s'utilitza qualsevol reactiu amb dimetil-p-fenilendiamina, però positiva si es fa servir el reactiu de oxidasa de Kovacs (tetrametil-p-fenilendiamina).

-Mitjans que continguin glucosa interfereixen en la prova, donant falsament negatius.

-Les soques de Bordetella pertussis poden donar reacció falsament positiu si provenen de plaques d'agar sang molt concentrades.

-El ús de nanses de metall (ferro) donen reacció falsament positiva.

recomanacions

-A causa de que els reactius són molt inestables i tendeixen a acte-oxidar es recomana congelar alíquotes d'1 a 2 ml i anar traient conforme es va necessitant.

-Una altra forma de retardar l'auto-oxidació de l'reactiu és afegir àcid ascòrbic a l'0,1% a l'hora de preparar els reactius.

-Com els reactius són inestables es recomana realitzar un control de qualitat setmanalment.

-Els reactius que no passin la prova de control de qualitat, no han de ser usats.

referències

1. Köneman I, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnòstic Microbiològic. 5ta ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnòstic Microbiològic de Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
3. «Prova de la Oxidasa.» Viquipèdia L'enciclopèdia lliure. 15 gen 2018, 10:32 UTC. 3 abr 2019, 14:03
4. Organització Mundial de la Salut. Manual de Laboratori per a la Identificació i Prova d'Susceptibilitat als Antimicrobians de Patògens Bacterians d'Importància per a la Salut Pública en el Món en Desarrollo.2004. Disponible a: who.int/drugresistance/infosharing
5. Tires reactives per al diagnòstic d'activitat oxidasa en els bacteris. Rev Cubana Med Trop. 2000; 52 (2): 150-151.