PROVA DE LA CATALASA: FONAMENT, TÈCNICA I USOS - BIOLOGIA - 2025

La prova de la catalasa és una metodologia usada en els laboratoris de bacteriologia per posar en evidència la presència de l'enzim catalasa en aquelles bacteris que la posseeixen. Al costat de la coloració de Gram són les principals proves que se li han de fer als microorganismes recentment aïllats. Aquestes proves orienten el microbiòleg sobre els passos a seguir per a la identificació definitiva de l'microorganisme en qüestió.

En general els bacteris que contenen citocrom posseeixen l'enzim catalasa, és a dir, que els bacteris aerobis i anaerobis facultatives haurien posseir-la. No obstant això, hi ha excepcions, com ara els Streptococcus, que tot i ser microorganismes anaerobis facultatius no posseeixen l'enzim catalasa.

Execució de la Prova de la catalasa, mostrant una reacció positiva. Font: No machine-readable Autor provided. Nase assumed (based on copyright claims).

És per això que la prova de la catalasa s'usa principalment per a distingir a les famílies Staphylococaceae i Micrococaceae (ambdues catalasa positives) de la família Streptococaceae (catalasa negativa).

Així mateix, el gènere Bacillus (catalasa positiva) es distingeix de l'gènere Clostridium (catalasa negatiu), entre d'altres.

fonament

La catalasa és un enzim classificada com una hidroperoxidasa, això vol dir que utilitzen com a substrat a el peròxid d'hidrogen (H ₂ O ₂).

També se li considera una oxidoreductasa, ja que en la reacció on participa hi ha un element que serveix com a donant d'electrons (substància reductora) i un altre com a receptor d'electrons (substància oxidant).

La catalasa és una proteïna que conté un grup prostérico amb quatre àtoms de ferro trivalents (Fe ⁺⁺⁺), per tant és una homoproteína. L'ió fèrric es manté oxidat durant la reacció.

Es pot dir que la catalasa és un enzim desintoxicant, ja que la seva funció és eliminar substàncies que es produeixen durant el metabolisme bacterià que són tòxiques per als bacteris. Entre aquestes substàncies hi ha el peròxid d'hidrogen.

El peròxid d'hidrogen es forma de la descomposició dels sucres per la via aeròbica. Aquest procés ocorre de la següent manera:

L'ió superòxid (O ₂ ^-) (radical lliure) es forma com a producte final de l'assimilació de la glucosa per la via aeròbia. Aquest és tòxic i és eliminat per l'enzim superòxid dismutasa que el transforma en oxigen gasós i peròxid d'hidrogen.

El peròxid d'hidrogen també és tòxic per als bacteris i ha de ser eliminat. L'enzim catalasa desdobla el peròxid d'hidrogen en aigua i oxigen.

La catalasa pot actuar sobre altres substrats diferents a l'peròxid d'hidrogen, com alcohols, aldehids, àcids, amines aromàtiques i fenols. No obstant això, el peròxid d'hidrogen pot ser utilitzat també per la catalasa per oxidar altres compostos tòxics com l'alcohol metílic i etílic.

Així mateix, la catalasa està present en les cèl·lules fagocítiques, protegint-la de l'acció tòxica de l'peròxid d'hidrogen.

Tècnica de rutina per a la prova de la catalasa

-Mètode en portaobjeto

materials

Peròxid d'hidrogen a el 3% (10 volums).

làmina portaobjeto

Nansa plàstica sol ús o escuradents de fusta.

procediment

Prendre suficient quantitat de la colònia a estudiar sense tocar l'agar d'on prové. La colònia ha de ser fresca, és a dir, d'un cultiu de 18 a 24 hores.

Col · locar la colònia sobre el portaobjeto sec i sobre ella afegir una gota de peròxid d'hidrogen a el 3% (també es pot fer servir H ₂ O ₂ a l'30%). Observar immediatament si es desprenen bombolles o no.

interpretació

Reacció positiva: despreniment de gas, que s'evidencia amb la formació de bombolles (bombolleig fort).

Reacció negativa: no hi ha formació de bombolles.

-Mètode directe en cultiu pur

Posar 1 ml d'H ₂ O ₂ a 3% sobre un cultiu pur en plaques o en falques que no contingui sang (preferiblement agar nutritiu). Observar si existeix o no formació de bombolles de forma immediata. També es pot usar H ₂ O ₂ a l'30%.

S'interpreta igual que el mètode de porta objecte.

-Mètode amb tub capil·lar o de Fung i Petrishko

Omplir un tub capil·lar de 67 mm a una alçada de 20 mm amb peròxid d'hidrogen a el 3% per capil·laritat.

Tocar la colònia aïllada que es desitja estudiar amb el capil·lar ple de H ₂ O ₂ a 3% . Observar si el capil·lar s'omple de bombolles en 10 segons aproximadament. Aquest mètode permet semi-quantificar la reacció en creus:

Sense creus no hi ha bombolles (reacció negativa).

+ ---- Escasses bombolles (reacció feble o retardada).

++ --- Abundant bombolles (reacció moderada).

+++ --Les bombolles arriben a l'extrem contrari (reacció enèrgica).

-Mètode de Taylor i Achanzar per a proves de catalasa que donen dubtoses

En un portaobjeto net i sec col·locar una colònia aïllada, després col·locar una gota d'H ₂ O ₂ a l'0,5% i cobrir amb un cobreobjectes. Observar si hi ha o no formació de bombolles empresonades.

Interpretació: la presència de bombolles indica una reacció positiva. Sense bombolles, s'interpreta com una reacció negativa.

Prova de la catalasa per a espècies de Mycobacterium

Aquesta tècnica necessita realitzar controlant el pH i la temperatura. S'ha d'executar sota una campana de flux laminar, ja que la manipulació de les diferents espècies de Mycobacterium és perillosa.

-Materials

Peròxid d'hidrogen a el 30% o 110 volums (superoxal).

Buffer fosfat pH 7

Tween 80 a el 10%

Cultiu de Mycobacterium en falca de 3 a 4 setmanes

-Preparació

Buffer fosfat pH 7

pesar:

1,361 g de (KH ₂ PO ₄) fosfat monopotàssic anhidre.

1,420 g de (Na2HPO3) fosfat disòdic anhidre.

Dissoldre les dues sals en una mica d'aigua destil·lada estèril i completar amb aigua fins a 1000 ml.

Tween 80 a el 10%

Realitzar una dilució 1:10 a l'Tween 80 que ve comercialment concentrat, per a això procedir de la següent manera:

Prendre 1 ml de Tween 80 i col·locar-lo en una mica d'aigua destil·lada, dissoldre i després completar el volum amb aigua fins a 10 ml.

reactiu final

Barrejar una quantitat de memòria intermèdia fosfat amb una quantitat de Tween 80 a el 10% (a parts iguals). Definir en el laboratori com més es desitja preparar.

-Procediment

Posar 5 ml de memòria intermèdia fosfat en un tub d'assaig estèril amb tapa de rosca (Baquelita).

Amb una nansa d'inoculació, prendre suficient colònia d'un creixement de Mycobacterium sembrat en falques i dissoldre en el buffer fosfat.

Tapar el tub sense prémer massa la rosca. Col · locar en un bany de Maria a 68 ° C per 20 a 30 minuts. Treure i deixar refredar a 22-25 ° C

Mesurar 0,5 ml de l'reactiu final (barreja) i addicionar a el tub amb la solució freda. Observar la formació o no de bombolles.

S'interpreta igual que les tècniques anteriors.

ús

Quan s'obté un creixement de colònies en mitjans enriquits se li ha de realitzar una tinció de Gram i una prova de catalasa a les colònies obtingudes. Això orientarà el microbiòleg sobre els procediments a seguir per a la identificació definitiva.

Font: Elaborada per l'autora MSc. Marielsa Gil

Control de qualitat

Per avaluar el bon funcionament de l'reactiu de peròxid d'hidrogen faci servir ceps controls recent cultivades, com ara Staphylococcus aureus com a control positiu i ceps de Streptococcus sp com a control negatiu.

Una altra alternativa que serveix com a control positiu és col·locar una gota de peròxid d'hidrogen sobre l'agar sang, els eritròcits tenen catalasa, per tant, hi haurà un bombolleig si el reactiu està en bones condicions.

Es pot usar un agar xocolata com a control negatiu, aquí els eritròcits ja estan lisats i la prova dóna negativa.

limitacions

-No utilitzar cultius vells per a la prova, ja que això pot originar falsos negatius.

-Evitar prendre colònies a partir de cultius en agar sang, si es fa anar amb compte de no tocar l'agar; aquest procediment pot provocar falsos positius, ja que els eritròcits contenen catalasa.

-Si pren la colònia amb nansa de platí no inverteixi l'ordre el procediment perquè això pot generar falsos positius. Això es deu al fet que el platí és capaç de reaccionar amb el peròxid d'hidrogen, originant un bombolleig.

-No utilitzeu el reactiu de peròxid d'hidrogen si està molt vell, ja que el reactiu és molt inestable i tendeix a descompondre amb el temps.

-Conservar el reactiu de peròxid d'hidrogen protegit de la llum i en refrigeració per evitar que es faci malbé.

Realitzar un control de qualitat a l'reactiu de peròxid d'hidrogen cada vegada que es faci servir.

-Prendre en compte que si es fa servir el H ₂ O ₂ a l'30% les reaccions són més forts que les que es realitzen amb H ₂ O ₂ a el 3%.

referències

1. Köneman I, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnòstic Microbiològic. 5ta ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnòstic Microbiològic de Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
3. Mac Faddin J. (2003). Proves bioquímiques per a la identificació de bacteris d'importància clínica. 3era ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
4. Laboratoris BD. Reactiu de catalasa-Gotario. Disponible a:
5. Laboratoris Vadequímica. Aigua oxigenada. Equivalència entre volums i percentatge. Disponible a: vadequimica.com