IMMUNOFLUORESCÈNCIA: FONAMENT, PROTOCOL I APLICACIONS - BIOLOGIA - 2025

La immunofluorescència és una poderosa tècnica de immunomarcatge que utilitza anticossos units covalentment a molècules fluorescents per identificar blancs específics en mostres cel·lulars fixades sobre un suport sòlid.

Aquesta tècnica l'observació microscòpica amb l'especificitat immunològica, fent possible l'observació de cèl·lules vives o mortes que poden presentar minúscules quantitats d'antígens. És àmpliament utilitzada tant en el camp de la investigació com en el diagnòstic clínic de diverses patologies.

Immunomarcatge dels filaments d'actina en cèl·lules de cardiomiòcits (Font: Ps1415 via Wikimedia Commons)

Aquesta tècnica, principalment qualitativa (amb algunes variants quantitatives), té a veure específicament amb la visualització d'una mostra pel senyal producte d'un fluoròfor, que és una molècula fluorescent unida a un anticòs i que és capaç d'excitar-a determinada longitud d'ona.

En el context cel·lular resulta de gran utilitat per a estudiar la presència / absència i la ubicació subcel·lular de proteïnes. La tècnica va ser emprada en els seus inicis en l'àmbit clínic per al diagnòstic de virus com la influença i subseqüentment per al de moltes altres malalties infeccioses.

És una tècnica de gran sensibilitat, i amb l'equip adequat de microscòpia, pot tenir molt bona resolució. Requereix, per a la seva observació, de l'ús de microscopis confocals o d'epifluorescència.

No obstant això, tot i ser molt popular, pot presentar alguns problemes importants respecte a l'obtenció de fluorescència inespecífica que genera cert "soroll" de fons, el que limita moltes vegades la lectura adequada dels resultats.

fonament

La immunofluorescència es basa en l'explotació de l'fenomen biològic de la reacció d'interacció entre un anticòs i un antigen. Té a veure concretament amb la visualització o detecció d'aquesta reacció a l'excitar les molècules fluorescents a una longitud d'ona específica.

Un anticòs és una proteïna immunoglobulina secretada a partir de cèl·lules B actives, i que és generat específicament contra un antigen, a el qual pot unir-se amb gran afinitat i especificitat. La immunofluorescència fa ús de les immunoglobulines IgG, que es troben de forma soluble en el sèrum sanguini.

Els anticossos són molècules de fins a 950 kDa compostes per dues cadenes peptídiques curtes (lleugeres) i dues llargues en forma de "I" (pesades). Tant les cadenes lleugeres com les pesades es divideixen en dos dominis: un de variable, capaç de reconèixer l'antigen, i un altre constant o conservat, característic de cada espècie.

Els antígens es defineixen funcionalment com les molècules que poden ser reconegudes per un anticòs i són, majoritàriament, proteïnes. Quan un animal és exposat a un antigen, els limfòcits de el sistema immune s'activen, produint anticossos específics contra aquest i que funcionen com a sistema de defensa.

Un antigen, com una proteïna, per exemple, pot tenir més d'un epitope o lloc de reconeixement per un anticòs, de manera que el sèrum de l'animal exposat a un antigen pot tenir anticossos policlonals contra diferents regions de la mateixa proteïna.

La immunofluorescència, llavors, explota la capacitat d'un animal per produir anticossos policlonals contra un antigen específic en nom de purificar-i emprar posteriorment per a la detecció de el mateix antigen en altres contextos.

Entre els tints o molècules fluorescents més emprats per a algunes tècniques d'immunofluorescència hi ha el isotiocianat de fluoresceïna (FITC), el isotiocianat de tetrametilrodamina.5.isotiocianat i 6 (TRITC), moltes cianinas com Cy2, Cy3, Cy5 i Cy7 i tints denominats Alexa Fluor®, com l'Alexa Fluor®448.

protocol

El protocol d'immunofluorescència varia en dependència de molts factors, però i en línies generals, engloba una seqüència lineal de passos que consisteixen en:

• Preparació de les làmines i de les cèl·lules
• Fixació de les mostres
• permeabilització
• bloqueig
• Immunotinció o immunomarcatge
• Muntatge i observació

-Preparació

De les mostres

La preparació de les mostres dependrà de la seva naturalesa i de l'tipus d'experiència a realitzar. A continuació, s'explicarà el cas més senzill, que implica l'ús de cèl·lules en suspensió.

Les cèl·lules en suspensió, és a dir, en un mitjà de cultiu líquid, han de primer separar-se d'aquest per centrifugació i després han de ser rentades amb una solució tampó o "buffer" isosmótico, que preservi la seva integritat.

Normalment es fa servir un tampó fosfat-salí conegut com PBS, en el qual es resuspenden les cèl·lules i aquesta barreja torna a centrifugar per obtenir les cèl·lules lliures de el mitjà de cultiu, que pot tenir substàncies interferents.

De les làmines

Les làmines emprades per a l'observació microscòpica, on posteriorment seran fixades les cèl·lules per als tractaments corresponents aigües avall, també han de ser preparades amb cura.

Aquestes són cobertes o "sensibilitzades" amb una solució de poli-lisina, un polímer sintètic que farà de "cola molecular" entre les cèl·lules i el suport sòlid, gràcies a la interacció electrostàtica entre les càrregues positives dels seus grups amino i les càrregues negatives de les proteïnes que recobreixen a les cèl·lules.

Fixació de les mostres

Aquest procés consisteix a immobilitzar les proteïnes que es troben a l'interior cel·lular amb la finalitat de mantenir intacta la seva ubicació espacial. Les molècules que s'empren han de poder travessar tots els tipus de membranes cel·lulars i de formar entramats amb les proteïnes covalents.

Són molt utilitzats el formaldehid i paraformaldehid, el glutaraldehid i fins i tot el metanol, amb el qual s'incuben les mostres cel·lulars per un temps determinat per després rentar-les amb una solució tampó de caràcter isosmótico.

Després de la fixació de les cèl·lules es prossegueix a unir-les a les làmines prèviament sensibilitzades amb poli-lisina.

permeabilització

Depenent de l'tipus d'assaig que es realitzi serà necessari permeabilitzar o no les cèl·lules en estudi. Si el que es busca és conèixer la ubicació, presència o absència, de determinada proteïna a la superfície cel·lular, la permeabilització no serà necessària.

En canvi, si es vol conèixer la localització d'una proteïna a l'interior cel·lular, la permeabilització és indispensable i consistirà en incubar les mostres amb Tritó X-100, un detergent capaç de permeabilitzar les membranes cel·lulars.

bloqueig

Un pas fonamental en totes les tècniques immunològiques és el bloqueig. En aquesta etapa de procediment, el bloqueig consisteix a cobrir, en les làmines sensibilitzades, tots els llocs amb molècules de poli-lisinas als quals no es van adherir cèl·lules. És a dir, prevé qualsevol unió inespecífica.

Normalment per al bloqueig s'utilitzen solucions amb albúmina de sèrum bovina (BSA) en tampó PBS i els millors resultats s'obtenen com més llarg és el temps d'incubació amb aquesta solució. Després de cada pas, incloent el de l'bloqueig, és menester remoure mitjançant rentats la solució romanent.

Immunotinció o immunomarcatge

El procediment de immunotinció o immunomarcatge dependrà principalment si es tracta d'una immunofluorescència directa o indirecta (veure més endavant).

Si es tracta d'una immunofluorescència primària o directa, les mostres s'incubaran amb els anticossos desitjats, que hauran estan acoblats als tints fluorescents. El procediment d'incubació consisteix a fer una dilució de l'anticòs en una solució que també contindrà BSA però en una menor proporció.

Quan el cas és el d'una immunofluorescència secundària o indirecta han realitzar-se dues incubacions consecutives. Primer amb els anticossos desitjats i després amb els anticossos que són capaços de detectar les regions constants de les immunoglobulines primàries. Són aquests anticossos secundaris els que estan units covalentment als fluoròfors.

La tècnica resulta molt versàtil, permetent fer marcatges simultanis de més d'un antigen per mostra, sempre que es tinguin anticossos primaris acoblats a diferents fluoròfors, en el cas de la immunofluorescència directa.

Per als marcatges simultanis a la immunofluorescència indirecta cal assegurar-se que cada anticòs primari sigui produït en un animal diferent, així com també que cada anticòs secundari estigui acoblat a un fluoròfor diferent.

A l'igual que el bloqueig, la incubació amb els anticossos dóna millors resultats mentre més gran sigui el temps d'aquesta. Després de cada pas cal rentar l'excés d'anticossos que no es van unir a les mostres i en la immunofluorescència secundària és necessari bloquejar abans d'afegir l'anticòs secundari.

Certes tècniques fan servir altres tints que no tenen a veure amb immunomarcatge, com ara la tinció de l'ADN nuclear amb el fluoròfor DAPI.

Muntatge i observació

Durant el temps d'incubació final amb els fluoròfors cal que les mostres romanguin en la foscor. Per l'observació a l'microscopi és comú emprar algunes substàncies per a la preservació de la fluorescència dels fluoròfors acoblats als anticossos.

tipus

Resum gràfic de la immunofluorescència directa i indirecta (Font: Westhayl618 via Wikimedia Commons)

Immunofluorescència directa o primària

Té a veure amb la detecció d'antígens mitjançant l'ús d'anticossos fluorescents. L'avantatge principal d'l'ús d'aquesta tècnica és la seva rapidesa, però, molts casos d'unió inespecífica poden donar-se en el procés, particularment a l'estudiar sèrums humans, ja que són rics en anticossos molt heterogenis.

Immunofluorescència indirecta o secundària

Es coneix també com la tècnica de "sandvitx" i aquesta implica el desenvolupament de la tècnica en dos passos. El primer té a veure amb l'ocupació d'un anticòs no fluorescent i la seva unió a l'antigen d'interès.

Contra la regió constant d'aquest primer anticòs (que ara servirà d'antigen) s'utilitza un segon anticòs capaç de reconèixer-ho, que sí que està associat a una molècula fluorescent.

L'aparició d'un senyal fluorescent serà el resultat de el reconeixement específic entre el primer anticòs no fluorescent i l'antigen d'interès; la presència d'aquest primer anticòs condiciona la de el segon, que sí que està etiquetatge i gràcies a el qual podrà determinar la presència o absència de l'antigen.

Tot i ser una tècnica que consumeix molt més temps que la immunofluorescència directa (ja que inclou un pas més d'incubació), aquesta tècnica no implica el disseny d'un anticòs fluorescent per cada antigen que s'estudia, el que resulta, en termes econòmics, més viable.

A més, és una tècnica més sensible en termes d'amplificació de senyal, ja que més d'un anticòs secundari pot unir-se a la regió constant de l'anticòs primari, amplificant així la intensitat del senyal fluorescent.

aplicacions

Com va poder haver-se notat anteriorment, la immunofluorescència és una tècnica summament versàtil, a la qual s'han donat multiplicitat d'usos en l'àmbit científic i clínic. Pot ser utilitzada per a respondre preguntes ecològiques, genètiques i fisiològiques respecte a molts organismes.

Entre les aplicacions clíniques s'empra per al diagnòstic directe d'algunes malalties dermatològiques, bé sigui emprant immunofluorescència directa o indirecta sobre teixit epitelial dels pacients estudiats.

S'ha disposat de les tècniques d'immunofluorescència en organismes unicel·lulars com els llevats per visualitzar els microtúbuls intranuclears i citoplasmàtics, actina i proteïnes associades, els filaments de 10nm i altres constituents de l'citoplasma, de la membrana i les parets cel·lulars.

referències

1. Abcam, Immunocytochemistry and Immunofluorescence protocol. Retrieved from abcam.com
2. Greph, C. (2012). Fluorescent Dyes. Retrieved from leica-microsystems.com
3. Miller, DM, & Shakest, DC (1995). Immunofluorescence Microscopy. In Methods in Cell Biology (Vol. 48, pp. 365-394). Academic Press, Inc.
4. Odell, ID, & Cook, D. (2013). Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology, 133, 1-4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG, & Brian, K. (1991). Immunofluorescence methods for yeast. In Methods of Enzymology (Vol. 194, pp. 565-602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, I. V, & Widelock, D. (1964). Applications of Immunofluorescence in Public Health Virology. Bacteriological Reviews, 28 (4), 402-408.
7. Vrieling, EG, & Anderson, DM (1996). Immunofluorescence in phytoplankton research: applications and potential. J: Phycol., 32, 1-16.