FROTIS BACTERIÀ: CARACTERÍSTIQUES I PREPARACIÓ - BIOLOGIA - 2025

El frotis bacterià és una extensió en forma de pel·lícula prima d'una suspensió de microorganismes bacterians que s'efectua sobre una placa de vidre transparent o portaobjectes, per a la seva observació sota un microscopi òptic.

L'extensió en forma de pel·lícula s'efectua amb l'objecte de separar els microorganismes en la mesura possible, ja que si estan agrupats l'observació no és nítida.

Figura 1. Frotis de bacteris vist a el microscopi electrònic de rastreig. Font: pixbay.com

En l'estudi de cultius bacterians es fan servir tècniques de preparació de frotis, de fixació i de coloració per analitzar-millor. A causa de la mida tan petit dels microorganismes, es requereix necessàriament l'ús d'un microscopi òptic per a la seva observació.

Els microscopis òptics són instruments indispensables per a l'observació dels frotis. Aquests fan servir lents òptiques i llum permetent la visualització de les mostres amb gran augment de la mida.

En general, les cèl·lules vives no tenen estructures majorment acolorides, vistes a l'microscopi òptic són mostres incolores, transparents, i mostren molt poc contrast intern i amb el seu entorn.

L'observació amb el microscopi òptic senzill de camp clar, sense l'ús de tècniques auxiliars de tinció, està molt limitada i només s'utilitza en alguns casos, com en l'observació de el moviment de microorganismes.

Per a l'observació dels microorganismes de manera òptima, cal aconseguir un balanç entre el contrast i la resolució. Els detalls de les cèl·lules no poden observar-se a l'microscopi, encara amb alta resolució; es requereix l'ús de colorants a través de tècniques de tinció, que aportin contrast per a l'observació.

Característiques d'un frotis bacterià de bona qualitat

excel·lent contrast

Per aconseguir un excel·lent contrast hi microscopis sofisticats anomenats microscopi de contrast de fases, d'interferència diferencial i microscopi de camp fosc. Aquest tipus de microscopi s'utilitza per observar estructures bacterianes com beines i filaments, entre d'altres.

La tinció és una tècnica senzilla per augmentar el contrast que s'aconsegueix amb un microscopi de camp clar. En aquesta tècnica es poden utilitzar diferents colorants que milloren notablement l'observació a l'microscopi.

Les tincions s'efectuen directament sobre els frotis o extensions de les suspensions de microorganismes sobre els portaobjectes, prèviament assecats i fixats.

bon fixat

La fixació és una tècnica que s'utilitza per preservar les estructures cel·lulars; provoca inactivació dels microorganismes i adhesió a el vidre de l'portaobjectes. Hi ha diferents tractaments de fixació: la fixació per calor i la fixació química.

Fixació per calor

Aquest és el mètode més utilitzat en l'observació de frotis bacterià. La tècnica consisteix a passar la suspensió bacteriana de l'frotis per la flama d'un encenedor. Aquesta tècnica és capaç de preservar la morfologia externa dels bacteris, però destrueix les seves estructures internes.

fixació química

La fixació química empra substàncies químiques en la preservació, com ara el formaldehid o formol, l'etanol i l'àcid acètic, entre d'altres. L'avantatge d'emprar agents químics fixadors, és que s'aconsegueix la preservació de les estructures cel·lulars internes dels microorganismes.

Figura 2. Frotis sanguini. Font: Bobjgalindo, from Wikimedia Commons

bona tinció

Els procediments més comuns per efectuar la tinció d'un frotis prèviament assecat i fixat són la tinció positiva o simple, la tinció diferencial i la tinció negativa. Existeixen també tècniques especials per tinció d'estructures cel·lulars particulars (de càpsula, d'espores, de flagels).

Tinció positiva o tinció simple

La tinció positiva o simple és la tècnica de tinció de frotis més emprada. Utilitza colorants que tenen la capacitat d'unir-se a certes estructures microbianes, permetent observar-les a l'microscopi.

Aquests colorants posseeixen grups cromòfors (porció acolorida) en la seva estructura química, amb enllaços dobles alternats i enllaços senzills (conjugació). Aquests enllaços poden al seu torn establir enllaços iònics o covalents amb algunes estructures cel·lulars.

Els colorants emprats en la tinció positiva o simple són majoritàriament derivats químics de l'anilina (sals orgàniques acolorides).

D'altra banda, entre els colorants podem trobar alguns amb pH bàsic i altres amb pH àcid.

colorants bàsics

En els colorants bàsics, el grup cromòfor posseeix càrrega elèctrica positiva. La gran majoria dels microorganismes procariotes tenen un pH intern neutre, i la seva superfície cel·lular té càrrega negativa. A través d'aquesta interacció electrostàtica, el cromòfor s'uneix a la cèl·lula i la tenyeix.

Exemples de colorants bàsics són el blau de metilè, el cristall violeta, el verd malaquita, la fuscina bàsica, la safranina, entre d'altres.

colorants àcids

En els colorants àcids el grup cromòfor posseeix càrrega elèctrica negativa. Aquests es fan servir per a la tinció de proteïnes amb grups amino de càrrega positiva. Exemples de colorants àcids són la fuscina àcida, la rosa de Bengala, el vermell Congo i la eosina.

tinció diferencial

La tècnica de tinció diferencial consisteix a aplicar dos colorants de diferent color o intensitat, per distingir microorganismes diferents a l'microscopi. La tinció de Gram i la tinció de resistència àcid-alcohol, són les tincions diferencials més emprades en bacteriologia.

La tinció de Gram s'empra com a prova preliminar per conèixer la forma, la mida, agrupació cel·lular, a més del tipus de paret cel·lular. Mitjançant la prova de tinció de Gram, els bacteris amb paret cel·lular es classifiquen en bacteris Gram positives i bacteris Gram negatives.

tinció negativa

En aquesta tècnica es fan servir colorants químics que no penetren a l'interior cel·lular, però fan que el medi en què hi ha els microorganismes aparegui com un fons negre.

En la tècnica de tinció negativa, el frotis s'elabora amb una gota de suspensió de tinta xinesa o de nigrosina, que després de permetre l'assecat a temperatura ambient forma una pel·lícula opaca a el pas de la llum. D'aquesta manera, els microorganismes s'observen com a formes brillants sobre un fons fosc.

preparació

A. Frotis

1.- Rentar molt bé els portaobjectes, assecar amb paper absorbent i retolar. El rètol ha d'assenyalar contingut de la preparació, data i nom de qui l'ha processat.

2.- Encendre l'encenedor i esterilitzar la nansa d'inoculació en la flama fins roent.

3.- Deixar refredar la nansa.

4.- Prendre el tub de l'cultiu bacterià, retirar el tap i ràpidament passar la boca d'el tub prop de la flama de l'encenedor (flamejar).

5.- Introduir la nansa d'inoculació dins el tub que conté el cultiu bacterià i prendre la mostra.

6.- Si el cultiu està al mig líquid, col·locar la mostra presa amb la nansa al centre de l'portaobjectes i estendre-la amb cura en un cercle d'aproximadament 2 cm de diàmetre.

7.- Esterilitzar de nou la nansa d'inoculació.

8.- Permetre l'assecat de l'frotis a l'aire.

9.- Repetir els passos de el 3 a el 8 tres vegades.

10.- Si el cultiu està al mig sòlid, s'ha de col·locar prèviament al portaobjectes una gota d'aigua destil·lada. Això es fa per barrejar una petita mostra de l'cultiu presa amb la nansa d'inoculació, segons les indicacions dels passos 2 a 5 (condicions d'asèpsia).

11.- Estendre la mostra diluïda amb la gota d'aigua sobre el portaobjectes i repetir tres vegades.

B. Fixació

1.- Afegir als frotis secs -provinents de cultius enmig líquid-, dues gotes de metanol o etanol absolut.

2.- Permetre assecat a l'aire lluny de l'encenedor.

3.- Si el frotis prové d'un cultiu en medi sòlid, el fixat de l'frotis sec s'efectua amb calor, passant-2 a 3 vegades ràpidament per la zona més calenta de la flama de l'encenedor.

4.- Tocar la part inferior de l'frotis amb la part dorsal de la mà esquerra (per a dretans; cas contrari, emprar mà dreta) i verificar que estigui fred.

C. Tinció simple

1.- Addicionar a l'frotis 2 gotes de el colorant seleccionat i deixar actuar pel temps requerit en els protocols específics de cada colorant (generalment entre 1 i 5 minuts).

2.- Alguns colorants requereixen ús de calor per a la seva activació, en aquest cas cal ser molt curós a l'escalfar el portaobjectes en la flama de l'encenedor (manipular-lo amb pinces i evitar l'ebullició). Un sobreescalfament de l'frotis pot destruir les cèl·lules que es volen observar.

3.- Retirar l'excés de colorant rentant amb aigua destil·lada d'una piceta. Eliminar l'aigua de rentat, colpejant suaument el portaobjectes pel seu cant, inclinat sobre la taula de treball.

4.- Permetre assecat a l'aire.

5.- Depenent de l'tipus d'observació, s'usa o no un cobreobjectes en aquesta etapa. El cobreobjectes protegeix i preserva a l'frotis. Si s'efectua una observació per immersió en oli en aquesta etapa, no s'usa cobreobjectes però el frotis no es podrà preservar.

D. Preservació definitiva de l'frotis

1.- Submergir el frotis successivament en cadascuna de les solucions assenyalades a continuació, per un mínim de 5 minuts. La finalitat d'aquests "banys" és deixar completament deshidratat a l'frotis. S'ha de escórrer bé cada reactiu, abans d'introduir el frotis en el següent bany.

L'ordre dels banys deshidratants és el següent:

1. Etanol 70%
2. Etanol 95%
3. acetona pura
4. Barreja acetona -xilol 1: 1
5. xilol

Després permetre l'assecat a l'aire.

2.- Muntar el cobreobjectes, preferiblement de 22 × 22 mm, utilitzant bàlsam de Canadà o un altre mitjà per a muntatge.

referències

1. Briggs, G. (1965). Causal Factors in Microbiological Laboratory Accidents and Infections. US Army Biological Laboratories. Fort Detrick.
2. Cappucino, JG and Welch, CT (2017). Microbiology: A Laboratory Manual. Pearson.
3. Holt, JG Editor. (1977). The shorter Bergey 's Manual of Determinative Bacteriology. 8 ^th Baltimore: The Williams and Wilkins Co
4. Johnson, TR and Casi; CL (2018). Laboratory Experiments in Microbiology. Pearson.
5. Tille, P. (2017). Diagnostic Microbiology. 14 ^th St. Louis, USA: Elsiever, Inc.