ENDONUCLEASES: FUNCIONS, TIPUS I EXEMPLES - BIOLOGIA - 2025

Les endonucleases són enzims que tallen els enllaços fosfodiéster localitzats a l'interior de la cadena de nucleòtids. Els llocs de restricció de les endonucleases són molt variats. Algunes d'aquests enzims tallen a l'ADN (l'àcid desoxiribonucleic, el nostre material genètic) gairebé en qualsevol lloc, és a dir són inespecífiques.

En contrast, hi ha un altre grup de endonucleases que són molt específiques en la regió o seqüència que van a escindir. Aquest grup d'enzims es coneix com enzims de restricció, i són molt útils en la biologia molecular. En aquest grup tenim a les conegudes enzims Bam HI, Eco RI i Alu I.

Les endonucleases tallen internament a l'ADN.

Font: pixabay.com

Contrari a les endonucleases, hi ha un altre tipus de proteïnes catalítiques - les exonucleasas - que s'encarreguen de trencar els enllaç fosfodiéster a l'extrem de la cadena.

Endonucleases de restricció

Les endonucleases de restricció o enzims de restricció són proteïnes catalítiques que s'encarreguen d'escindir els enllaços fosfodiéster a l'interior de la cadena d'ADN en seqüències molt concretes.

Aquests enzims poden ser adquirides en múltiples empreses de biotecnologia i el seu ús és gairebé indispensable dins de les tècniques actuals de manipulació de l'ADN.

Les endonucleases de restricció es nomenen usant les primeres lletres del nom científic binomial de l'organisme de què provenen, seguit del cep (aquest és opcional) i finalitza amb el grup d'enzims de restricció a què pertanyen. Per exemple, Bam HI i Eco RI són endonucleases molt usades.

La regió d'ADN que l'enzim reconeix s'anomena lloc de restricció i és propi de cada endonucleasa, tot i que diversos enzims poden coincidir en els llocs de restricció. Aquest lloc consisteix, generalment, en una seqüència palindrómica curta d'unes 4 a 6 parells de bases de longitud, com AGCT (per Alu I) i GAATTC per Eco RI.

Les seqüències palindròmiques són seqüències que, tot i que es llegeixin en direcció 5 'a 3'o 3'a 5', són idèntiques. Per exemple, per al cas d'Eco RI, la seqüència palindrómica és: GAATTC i CTTAAG.

Funcions i aplicacions de les endonuclesas de restricció

Afortunadament per als biòlegs moleculars, els bacteris han desenvolupat en el curs de l'evolució un seguit d'endonucleases de restricció que fragmenten internament el material genètic.

En la naturalesa, aquests enzims han evolucionat - presumiblement - com un sistema de protecció bacteriana enfront de la invasió de molècules d'ADN forà, com les provinents dels fags.

Per poder discriminar entre el material genètic propi i forà, aquestes endonucleases de restricció poden reconèixer seqüències específiques de nucleòtids. Així, l'ADN que no tingui aquesta seqüència pot estar sense pertorbacions a l'interior del bacteri.

En contrast, quan la endonucleasa reconeix el lloc de restricció, s'uneix a l'ADN i el talla.

Els biòlegs estan interessats a estudiar el material genètic dels éssers vius. No obstant això, l'ADN està format de diversos milions de parells de bases de longitud. Aquestes molècules són extremament llargues i han de ser analitzades en petits fragments.

Per complir amb aquest objectiu, les endonucleases de restricció són integrades en els diversos protocols de biologia molecular. Per exemple, un gen individual pot ser capturat i replicat per a futures anàlisis. Aquest procés és anomenat "clonar" un gen.

Polimorfisme de longitud de fragments de restricció (RFLP)

Els polimorfismes de longitud de fragments de restricció fan referència a el patró de seqüències específiques de nucleòtids en l'ADN que les endonucleases de restricció són capaços de reconèixer i tallar.

Gràcies a l'especificitat dels enzims, cada organisme es caracteritza per un patró específic de tall en l'ADN, originant fragment de longituds variables.

Tipus de endonucleases de restricció

Històricament, les endonucleases de restricció s'han classificat en tres tipus d'enzims, designades amb nombres romans. Darrerament, s'ha descrit un quart tipus de endonucleasa.

tipus I

La característica més important de les endonucleases de l'tipus I és que són proteïnes formades per diverses subunitats. Cadascuna d'aquestes funciona com un sol complex proteic i usualment posseeixen dues subunitats anomenades R, dues M i una S.

La porció S és l'encarregada de el reconeixement de el lloc de restricció en l'ADN. La subunitat R, per la seva banda, és essencial per al clivatge i la M s'encarrega de catalitzar la reacció de metilació.

Hi ha quatre subcategories dels enzims de l'tipus I, conegudes per les lletres A, B, C i D, que són d'ús comú. Aquesta classificació està basada en la complementació genètica.

Els enzims de tipus I van ser les primeres endonucleases de restricció en ser descobertes i purificades. No obstant això, les més útils en biologia molecular són les de l'tipus II que seran descrites a la propera secció.

tipus II

Les endonucleases de restricció de l'tipus II reconeixen seqüències específiques d'ADN i realitzen el clivatge en una posició constant prop d'una seqüència que produeixi fosfats 5 'i hidroxils 3'. Generalment requereixen com a cofactors ions magnesi (Mg ²⁺), però hi ha algunes que tenen requeriments molts més específics.

Estructuralment, poden aparèixer com monòmers, dímers o fins tetràmers. La tecnologia recombinant fa servir a les endonucleases de tipus II i per aquesta raó s'han caracteritzat més de 3500 enzims.

tipus III

Aquests sistemes enzimàtics estan compostos per dos gens, denominats mod i res, que codifiquen per a les subunitats que reconeixen l'ADN i per a modificacions o restriccions. Les dues subuniudades són necessàries per a la restricció, procés totalment dependent de la hidròlisi de l'ATP.

Per poder escindir la molècula d'ADN, l'enzim ha d'interactuar amb dues còpies de la seqüència de reconeixement no palindrómica i els llocs han d'estar en una orientació inversa en el substrat. El clivatge és precedit per una translocació de l'ADN.

tipus IV

Un grup addicional ha estat identificat últimament. El sistema està compost de dos o més gens que codifiquen per proteïnes que s'escindeixen només seqüències d'ADN modificades, ja sigui metilat, hidroximetilado o glucosil hidrometilado.

Per exemple, l'enzim EckKMcrBC reconeix dues dinucleòtids de la forma general RMC; 1 purina seguida d'una citosina metilada, les quals poden estar separades per diverses parells de bases - des de 40 fins a gairebé 3000. L'escissió té lloc uns 30 parells de base després el lloc que l'enzim reconeix.

Endonucleases tipus V

Les endonucleases d'aquest tipus són també conegudes com endonucleases "homing". Aquests enzims reconeixen i tallen la seqüència diana d'ADN en llocs únics de l'genoma de 14 a 40 pb.

A menuts aquests enzims estan codificades en introns i es creu que la seva funció és promoure la transferència horitzontal de les seqüències tallades. Després de el tall es produeix una reparació de ruptura en la doble hèlix d'ADN basada en la seqüència complementària.

exemples

La endonucleasa I d'E coli actua com a sistema de defensa contra fags i paràsits. Està es localitza principalment entre la membrana citoplasmàtica i la paret cel·lular. Produeix trencaments bicatenarias en l'ADN forà amb el qual interactua en l'espai periplasmàtic.

Les endonucleases de tipus CRISPR-Cas són enzims que actuen en el mecanisme de defensa de molts tipus de bacteris. Aquestes identifiquen i tallen seqüències específiques d'ADN d'organismes invasors, que generalment són virus.

Recentment, investigadors de l'Institut de Tecnologia de Massachusetts (MIT) van descobrir el sistema d'edició genòmica CRISPR-Cas12bm amb una alta precisió per a la modificació de cèl·lules humanes.

referències

1. Burrell, MM (Ed.). (1993). Enzymes of molecular biology. Totowa, NJ: Humana Press.
2. Loenen, WA, Dryden, DT, Raleigh, EA, & Wilson, GG (2013). Type I restriction enzymes and their Relatives. Nucleic àcids research, 42 (1), 20-44.
3. Murray, PR, Rosenthal, KS, & Pfaller, MA (2017). Microbiologia mèdica + StudentConsult en espanyol + StudentConsult. Elsevier Health Sciences.
4. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restriction endonucleases in the analysis and restructuring of DNA molecules. Annual review of biochemistry, 44 (1), 273-293.
5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. Cellular and molecular life sciences, 62 (6), 685.