TINCIÓ NEGATIVA: FONAMENT, TÈCNICA, AVANTATGES I DESAVANTATGES - BIOLOGIA - 2025

La tinció negativa és un mètode de coloració especial per destacar la presència de la càpsula en alguns microorganismes -principalment Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae i Cryptococcus neoformans-, provinents de mostres clíniques o de cultius purs.

La mostra directa comunament utilitzada per aplicar tinció negativa és el líquid cefaloraquidi. Aquesta tècnica representa una alternativa ràpida per al diagnòstic presumptiu de meningitis, especialment per Cryptococcus neoformans.

A. Sarro dental tenyit amb tinta xinesa, B. Cryptococcus neoformans var gatti dèbilment encapsulat com apareix en la naturalesa, usant nigrosina. C. Cryptococcus neoformans var gatti amb una càpsula grossa com es troba en la seva forma parasitària, usant nigrosina. D. Cryptococcus neoformans amb tinta xinesa lleugerament diluïda. Gisell Quinde, from Wikimedia Commons / CDC, via Wikimedia Commons / Photo Credit: Content Providers (s): CDC / Dr. Leanor Haley, via Wikimedia Commons

Així mateix, aquesta tinció pot ser aplicada sobre esput i líquids estèrils en general, així com també sobre soques obtingudes de cultius purs joves. Aquesta tècnica utilitza nigrosina o tinta xinesa per a la seva execució; per tant, és una metodologia molt senzilla i econòmica d'aplicar que brinda informació de gran valor diagnòstic en poc temps.

En aquest sentit, qualsevol laboratori està en la capacitat de realitzar aquesta coloració. És clar, el laboratori ha de comptar amb un personal competent, capaç de reconèixer els llevats de l'Cryptococcus neoformans aïllat o en gemmació i diferenciar-les de leucòcits i artefactes que pugui presentar la mostra.

fonament

La nigrosina i la tinta xinesa actuen de manera similar; per això es pot utilitzar qualsevol de les dues substàncies indistintament.

Aquesta tècnica rep el nom de tinció negativa perquè actua de forma contrària a la resta de les tècniques de coloració. En aquesta el que queda sense tenyir és l'estructura que s'està buscant o que es desitja veure; és a dir, els microorganismes.

Per tant, la coloració es basa en tenyir el fons de l'frotis en un color fosc. En aquest escenari les estructures capsulades ressaltessin en color clar o incolor.

En general els llevats s'observen refringents, envoltades per un halo clar que correspon a la càpsula. Això passa perquè la tinta xinesa i la nigrosina són substàncies incapaços de penetrar el polisacàrid que conforma la càpsula dels microorganismes vius.

Val destacar que tampoc penetren altres estructures que poden estar presents a la mostra directa, com leucòcits o hematies.

Ara bé, si els microorganismes estan morts, la tintura pot penetrar dins dels mateixos, de manera que aquesta tinció també és útil per avaluar la viabilitat dels microorganismes.

tècnica

materials

nigrosina

La nigrosina deu el seu nom a la color negre que posseeix. És una substància sintètica que s'obté de l'escalfament de la barreja de compostos orgànics -com ara la nitrobencina, l'anilina i el hidroclorito de anilina-, utilitzant en aquesta reacció un catalitzador (ferro o coure).

tinta xinesa

La tinta xinesa és una substància utilitzada principalment pels asiàtics per l'escriptura, l'elaboració d'obres d'art i la pintura monocromàtica. És molt popular a la cultura xinesa.

S'obté de la tinta d'el calamar barrejada amb carbó polvoritzat, producte de la crema d'arbres poc resinosos.

També és possible preparar-la a partir d'el sutge de la incineració d'hidrocarburs (olis vegetals), juntament amb una gelatina proteica que li dóna la consistència adequada per evitar la precipitació de les partícules de carbó.

Especificacions per a la presa de mostra

- No requereix dejuni.

- La mostra de LCR, esput o líquid estèril ha de contenir al menys 1 ml de volum i ha de ser traslladada a temperatura ambient a laboratori de forma immediata.

- Les mostres de LCR i líquids estèrils han de ser preses per un metge especialitzat.

- També pot ser un cultiu pur d'un cep sospitosa vinculada amb els patògens ja esmentats.

Execució de la tècnica amb mostres directes

- Les mostres han de ser centrifugades, després es descarta el sobrenedant i es pren el sediment.

- En una làmina portaobjeto neta es col·loca una gota d'el material centrifugat (sediment) i una gota de tinta xinesa o nigrosina.

- Ha de barrejar bé i cobrir amb una làmina cobreobjectes, deixant que la gota s'estengui com una pel·lícula fina sense que ultrapassi les vores.

- Posteriorment es munta la preparació al microscopi.

- Si la preparació queda molt fosca, es pot diluir amb aigua.

Execució de la tècnica amb ceps provinents de cultiu

- Es pren una porció molt petita d'un cultiu jove amb una agulla de sembrat i es dissol en una gota de tinta xinesa col·locada prèviament sobre un portaobjectes net.

- Es col·loca un cobreobjectes a sobre.

- S'observa al microscopi a 10X i després a 40X.

També pot dissoldre una porció de la colònia en aigua destil·lada, i d'allí prendre una gota i barrejar-la amb la tinta xinesa. D'aquesta manera el preparat no quedarà tan gruixut, fent possible l'observació de les estructures en forma aïllada; si hi ha aglomeracions, no s'observarà bé.

Una altra metodologia és la següent:

- Posar una gota de l'cultiu en suspensió en un extrem de l'portaobjeto.

- Posar una gota d'nigrosina en el mateix extrem i barrejar.

- Amb ajuda d'un altre portaobjeto, estendre la mostra com si s'estigués fent un frotis hematològic.

- Deixar assecar i observar al microscopi.

Observació a microscopi

Primer s'ha d'enfocar amb objectiu de 10X per tenir una visió àmplia de camp. Posteriorment s'ha de buscar si hi ha espais clars; si n'hi ha, enfocar amb 40X per veure els detalls.

avantatges

- És fàcil d'executar.

- És una tècnica econòmica.

- Aquest mètode no requereix que el frotis sigui fixat a la calor ni amb productes químics; per tant, els microorganismes són observats sense distorsions.

- La preparació en fresc no necessita ser assecada, de manera que es pot observar immediatament, generant resultats de forma ràpida.

desavantatge

Un cop muntades, les preparacions en fresc han de ser observades immediatament; si es deixen assecar ja no és possible observar-les i s'haurà muntar una de nova.

Tinció de teixits amb tinta xinesa

Una altra funció que pot complir la tinta xinesa és en els laboratoris de patologia. Aquesta s'aplica en mostres de teixit extretes quirúrgicament amb la finalitat de marcar els marges de resecció de l'tumor.

El teixit marcat es ruixa amb àcid acètic. Aquest actua com un mordent i evita que la tinta es surti quan el teixit és sotmès a el processament de rutina per al preparat de la biòpsia.

El procediment consisteix a banyar el teixit en alcohol i xilè, i després embeure en cera de parafina. Aquest marcatge s'orienta a l'patòleg a l'hora d'observar el teixit, indicant-li on és el marge de resecció quirúrgica o un altre punt d'interès.

referències

1. «Nigrosina». Viquipèdia L'enciclopèdia lliure. 11 jul 2017, 22:46 UTC. 6 gen 2019, 16:56: es.wikipedia.org
2. «Tinta xinesa». Viquipèdia L'enciclopèdia lliure. 1 oct 2018, 03:08 UTC. 6 gen 2019, 18:20: es.wikipedia.org/
3. Silva L, Silva C, Fernández N, Bé C, Torres J, Rico M, Macías J i col·laboradors. (2006). Personal laboral de la comunitat autònoma d'Extremadura. Temari específic Volum IV. Editorial MAD. Sevilla-Espanya, pp 211-212.
4. Silva M, García M, Corrals J, Ponce I. (2006).Tècnic especialista en laboratori, de el Servei Gallec de Salut (SERGAS). Temari matèria específiques volum 2. Editorial MAD. Sevilla-Espanya, pp 79-80.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnòstic Microbiològic de Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA