TINCIÓ DE ZIEHL-NEELSEN: FONAMENT, REACTIUS I TÈCNICA - BIOLOGIA - 2025

La tinció de Ziehl-Neelsen en una tècnica de coloració per identificar microorganismes alcohol-àcid resistents (AAR). El nom d'aquest procediment de microbiologia fa referència als seus autors: el bacteriòleg Franz Ziehl i el patòleg Friedrich Neelsen.

Aquesta tècnica és un tipus de coloració diferencial, el que implica l'ús de diferents colorants amb la finalitat de crear contrast entre les estructures que es volen observar, diferenciar i posteriorment identificar. La tinció de Ziehl-Neelsen serveix per identifica certs tipus de microorganismes.

Tinció de Ziehl-Neelsen

Alguns d'aquests microorganismes són micobacteris (per exemple, Mycobacterium tuberculosi), nocardias (per exemple, Nocardia sp.) I alguns paràsits unicel·lulars (per exemple, Cryptosporidium parvum). Moltes de les bacteris poden classificar-se a través d'una tècnica comuna anomenada tinció de Gram.

No obstant això, alguns grups bacterians requereixen altres mètodes per poder identificar-los. Tècniques com la tinció de Ziehl-Neelsen requereixen combinacions de colorants amb calor per fixar el primer a la paret cel·lular.

Després ve un procés de decoloració que permet obtenir dos resultats: resistència o sensibilitat a la decoloració per àcids i alcohols.

fonament

El fonament d'aquesta tècnica de tinció es basa en les propietats de la paret cel·lular d'aquests microorganismes. La paret està formada per un tipus d'àcids grassos anomenats àcids micòlics; aquests es caracteritzen per presentar cadenes molt llargues.

Quan els àcids grassos presenten estructures molt llargues, aquests poden retenir els colorants amb més facilitat. Alguns gèneres de bacteris són molt difícils de tenyir mitjançant tinció de Gram, a causa de l'alt contingut d'àcids micòlics de la paret cel·lular.

En la tinció de Ziehl-Neelsen s'utilitza el compost fenòlic carbol fucsina, un colorant bàsic. Aquest té la capacitat d'interactuar amb els àcids grassos de la paret cel·lular, la qual és de textura cerosa a temperatura ambient.

La tinció amb carbol fucsina és millorada en presència de calor, pel fet que la cera es fon i les molècules de colorant es mouen amb més rapidesa cap a l'interior de la paret cel·lular.

L'àcid que s'usa posteriorment serveix per descolorir les cèl·lules que no van ser tenyides perquè la seva paret no era prou afí a l'colorant; per tant, la força de l'decolorant àcid és capaç d'eliminar el colorant àcid. Les cèl·lules que resisteixen aquesta decoloració es diuen àcid-resistents.

colorant secundari

Després de la decoloració de la mostra, aquesta es contrasta amb un altre colorant anomenat colorant secundari. Generalment s'utilitza el blau de metilè o el verd de malaquita.

El colorant secundari tenyeix el material de fons i, en conseqüència, crea contrast a les estructures que van ser tenyides en el primer pas. Només les cèl·lules decolorades absorbeixen el segon colorant (contra-tinció) i prenen el seu color, mentre que les cèl·lules àcid-resistents conserven el color vermell.

Aquest procediment s'usa freqüentment per a la identificació de Mycobacterium tuberculosis i Mycobacterium leprae, les quals són cridades bacils àcid-alcohol resistents.

reactius

colorant primari

S'usa carbol fucsina a l'0,3% (filtrat). Aquest colorant es prepara a partir d'una barreja d'alcohols: fenol en etanol (90%) o metanol (95%), i en aquesta barreja es dissolen 3 grams de fucsina bàsica.

solució decolorant

En aquest pas es poden emprar solucions d'àcid alcohol a el 3% o àcid sulfúric a l'25%.

Colorant secundari (contra-colorant)

El colorant més emprat per realitzar el contrast en les mostres sol ser el blau de metilè a l'0,3%. No obstant això, també es poden emprar altres, com el verd malaquita a l'0,5%.

tècnica

Procediment de tinció àcid-ràpida

Preparar un frotis bacterià

Aquesta preparació es fa en un portaobjectes net i sec, seguint les precaucions d'esterilitat.

Assecatge de l'frotis

Deixar que el frotis s'assequi a temperatura ambient.

Escalfar la mostra

La mostra s'ha d'escalfar aplicant foc a l'portaobjeto per sota. Es pot fer una fixació amb alcohol quan el frotis no s'ha preparat amb esput (tractat amb hipoclorit de sodi per blanquejar-) i si no es va a tenyir immediatament.

M. tuberculosis s'elimina amb lleixiu i durant el procés de tinció. La termofixació de l'esput no tractat no matarà a M. tuberculosis, mentre que la fixació amb alcohol és bactericida.

Cobrir la taca

La taca es cobreix amb la solució de carbol fucsina (colorant bàsic primari).

Escalfar la taca

Això es fa durant 5 minuts. Ha de notar un despreniment de vapor (aproximadament a 60 ° C). És important no sobreescalfar i evitar cremar la mostra.

Amb relació a l'escalfament de la taca, s'ha de tenir molta cura a l'escalfar la carbol fucsina, especialment si la tinció es porta a terme sobre una safata o un altre recipient en el qual s'hagin recollit productes químics altament inflamables de la tinció prèvia.

Només s'ha d'aplicar una petita flama sota dels portaobjectes utilitzant un hisop encès prèviament humitejat amb unes gotes d'alcohol àcid, metanol o etanol a l'70%. Evitar utilitzar un hisop gran amarat en etanol perquè això és un risc d'incendi.

Rentar la taca

Aquest rentat s'ha de fer amb aigua neta. Si l'aigua de l'aixeta no està neta, rentar el frotis amb aigua filtrada o destil·lada, preferiblement.

Cobrir el frotis amb alcohol àcid

Aquest alcohol àcid ha d'estar a el 3%. La cobertura es porta a terme durant 5 minuts o fins que el frotis estigui prou descolorit, és a dir, de color rosa pàl·lid.

Cal tenir en compte que l'alcohol àcid és inflamable; per tant, s'ha d'utilitzar amb molta cura. S'ha d'evitar estar a prop de fonts d'ignició.

Rentar la taca

El rentat ha de ser amb aigua neta, destil·lada.

Cobrir el frotis amb colorant

Pot ser colorant verd de malaquita (0,5%) o blau de metilè (0,3%) durant 1 o 2 minuts, utilitzant el temps més prolongat si el frotis és prim.

Rentar la taca

Novament s'ha d'utilitzar aigua neta (destil·lada).

drenar

S'ha de netejar la part posterior de l'portaobjeto i col·locar la taca en un prestatge de drenatge, perquè aquesta s'assequi a l'aire (no fer servir paper absorbent per a l'assecat).

Examinar el frotis al microscopi

Ha d'usar l'objectiu de 100X i l'oli d'immersió. Escanejar el frotis sistemàticament i anotar les observacions pertinents.

Interpretar els resultats

Teòricament, els microorganismes que es tenyeixin d'un color vermellós es consideren àcid alcohol resistent positius (AAR +).

A contra, si els microorganismes es tenyeixen de blau o verd, depenent de l'colorant utilitzat com contra-colorant, es consideren àcid alcohol resistent negatius (AAR-).

referències

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Essentials of Practical Microbiology (1st ed.). Jaypee Brothers Medical Publishers.
2. Bauman, R. (2014). Microbiology with Diseases by Body System (4th ed.). Pearson Education, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Introductory Microbiology (1st ed.). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). Laboratory Manual and Workbook in Microbiology: Applications to Patient Care (11th ed.). McGraw-Hill Education.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Textbook of Microbiology (1st ed.). BI Publications PVT.