TINCIÓ DE WRIGHT: FONAMENT, MATERIALS, TÈCNICA I USOS - BIOLOGIA - 2025

La tinció de Wrigth és una tècnica de coloració creada pel patòleg nord-americà James Homer Wright el 1902, a partir de la tinció de Romanowsky. Com la tinció de Romanowsky era inestable, Wrigth va incorporar el metanol com a dissolvent i fixador.

Aquesta coloració és policromàtica, el que vol dir que genera diversos colors depenent de l'estructura que absorbeix el colorant. Aquesta tècnica de coloració ha estat molt utilitzada per realitzar recomptes diferencials de glòbuls blancs i estudiar la morfologia dels glòbuls vermells, plaquetes i leucòcits en sang perifèrica i medul·la òssia.

Diversos frotis de sang perifèrica tenyits amb tinció de Wright. A. Leucèmia aguda B. Plasmodium vivax dins de l'eritròcit. C. Plasmodium falciparum, macrogametocito. D. Limfòcit

La seva aplicació és molt important, ja que es poden apreciar anormalitats en les diferents línies cel·lulars de la sang, facilitant el diagnòstic de malalties com la leucèmia o infeccions bacterianes o parasitàries.

Potser aquestes són les aplicacions més comuns en la qual és utilitzada aquesta tècnica, però no són les úniques. També és útil en altres mostres diferents a la sang i medul·la òssia, com per exemple en mostres de secreció nasal, moc fecal, esput, pell, entre d'altres.

Fonament de la tinció de Wright

La tinció de Wright va néixer de la tinció de Romanowsky, que consisteix en una solució d'alcohol metílic d'un colorant àcid (eosina I) i un altre bàsic (blau de metilè) i els seus productes d'oxidació.

La barreja de colorants usats en la tinció de Wright provoca l'efecte conegut com Romanowsky, és a dir, proporciona una bella coloració porpra als nuclis dels leucòcits i als grànuls neutrofílicos, mentre que els glòbuls vermells es tenyeixen de color rosat.

Els components responsables de donar la gamma de colors típica de la tinció de Wright són el blau B i l'eosina I. L'efecte observat dependrà de l'enllaç dels colorants a les estructures químiques ia les interaccions de el blau B i l'eosina Y.

Les estructures àcides com ara els àcids nucleics, les proteïnes nuclears i el citoplasma immadur reactiu d'alguns tipus de cèl·lules, fixen el blau B (colorant bàsic).

Mentre que les estructures bàsiques com ara l'hemoglobina, els grànuls dels segmentats eosinòfils, entre d'altres estructures cel·lulars, fixen l'eosina I (colorant àcid).

El resultat de tinció pot ser influït per diferents factors, com el pH de l'colorant Wright, de la solució amortidora i de rentat; així com el temps de tinció i de fixació.

Per això, cada pas en la preparació dels reactius és crucial i ha de ser realitzat cuidant cada detall.

materials

Colorant de Wright. Per 100 ml es requereix:

Pesar 0.3 g de colorant de Wright, mesurar 97 ml de metanol i 3 ml de glicerol.

preparació

En un morter col·locar la quantitat pesada de l'colorant de Wright i anar incorporant a poc a poc el glicerol fins que la pols quedi totalment dissolt.

Posteriorment s'agrega el metanol, es barreja i s'aboca en un flascó ambre.

Abans d'utilitzar s'ha d'agitar la solució amb moviments suaus i filtrar.

Solució amortidora tamponada

En un litre d'aigua destil·lada s'agrega 3,76 g de hidrofosfato disòdic (Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ 0) més 2,1 gr de fosfat de potassi dihidrogenado (KH ₂ PO ₄).

Barrejar molt bé fins dissoldre tots els reactius incorporats. Ajustar el pH a 7,2. Abocar en un pot de vidre i mantenir a temperatura ambient.

Materials addicionals necessaris per realitzar la coloració

Addicionalment requereixen altres materials per poder dur a terme la tècnica de coloració, aquests són: làmines porta objectes o cobreix objectes, pont de coloració, pisetas amb aigua o buffer per al rentat, un cronòmetre per portar els temps de coloració i algun material assecant (paper absorbent, gasa o cotó).

Components de la tinció de Wright

el metanol

L'alcohol (metanol) serveix com un fixador de l'frotis sanguini a l'portaobjectes.

Bàsicament és un reactiu reductor, deshidratador i fixador coagulant. Per tant, la seva funció és coagular les proteïnes i fer-les insolubles, però sense arribar a desnaturalitzar.

El metanol és el reactiu més utilitzat per fixar frotis en tots els laboratoris, ja que proporciona millors resultats que els obtinguts amb l'etanol. La concentració ideal és a 99%.

el amortidor

L'amortidor (solució tamponada), té com a funció ajustar o mantenir el pH de l'colorant, doncs un pH ajustat a 7,2 és essencial perquè les estructures cel·lulars puguin absorbir els colorants adequadament.

D'altra banda, el pas de la fixació amb metanol deshidrata les cèl·lules i l'amortidor ajuda a rehidratar-les.

Eosina (I)

La eosina té afinitat per components bàsics per ser un colorant àcid. Es coneixen dos tipus d'eosina molt similars entre si, tant que poden usar-se qualsevol de les dues, obtenint el mateix resultat.

Una s'anomena eosina I, eosina groga o tetrabromofluoresceína i l'altra eosina B, eritrosina B blavosa o dibromodinitrofluoresceína. No obstant això, l'eosina I és la que s'utilitza amb més freqüència.

La propietat més important d'aquest colorant és la seva polaritat negativa, això fa que sigui atret per estructures cel·lulars amb càrrega positiva.

Blau de metilè

És el colorant bàsic. La seva principal propietat és la metacromasia, és a dir, no totes les estructures es van a tenyir de el mateix color, depèn de la composició química de les estructures que està pintant.

Algunes es tornaran blau clar o fosc i altres de morat fosc o lila pàl·lid.

tècnica

1-Realitzar l'estès de la mostra de manera que quedi una pel·lícula prima, bé sigui en portaobjeto o cobreobjectes.

2-Deixar assecar a l'aire per 2 hores aproximadament.

3-Col·locar el frotis sec sobre el pont de coloració o cubeta de tinció amb l'estesa de la mostra cap amunt.

4-Cobrir la làmina amb el colorant de Wright gota a gota fins abastar tota la superfície. Deixar actuar durant 5 - 8 minuts.

5-El colorant ha de cobrir completament el portaobjeto, sense que es vessi per les vores. Si durant el temps de coloració es comença a evaporar s'hauran de col·locar unes gotes addicionals.

6-Posteriorment afegir una quantitat igual de l'amortidor, bufar una mica fins que aparegui el característic brillantor metàl·lica. Cronometrar 10 a 15 minuts.

7-Rentar amb aigua d'aixeta, col·locant el doll suau fins que la làmina es vegi rosada.

8-Amb una gasa impregnada d'alcohol eliminar el colorant adherit al dors de l'portaobjectes.

9-Deixar assecar molt bé el frotis abans de col·locar l'oli d'immersió per visualitzar-lo al microscopi.

utilitat

Hematologia

És ideal per a la tinció de frotis de sang perifèrica, per a l'examen de gota gruixuda de sang i per a l'estudi de cèl·lules de mostres de medul·la òssia.

A causa de les propietats químiques d'aquesta combinació de colorants les estructures cel·lulars poden ser fàcilment reconegudes, podent-se distingir els diferents tipus de cèl·lules presents.

secreció Nasal

Aquesta tècnica és molt útil per identificar les cèl·lules de la secreció nasal (cèl·lules epitelials, segmentats eosinòfils, polimorfonuclears) en el diagnòstic de rinitis al·lèrgiques.

Parasitologia

En aquest sentit, ha estat útil per a l'estudi de Leishmania sp dins dels histiòcits de el teixit cel·lular subcutani en úlceres de la pell. Així mateix, és emprada per identificar leucòcits en mostra de femta (leucograma fecal).

En aquest cas, és d'interès per al metge saber si la leucocitosi present en la femta és per polimorfonuclears o mononuclears. Aquesta troballa al leucograma fecal orientarà si es tracta d'una infecció bacteriana o viral respectivament.

D'altra banda, els paràsits que circulen en la sang poden trobar-se dins de l'eritròcit o lliures en el plasma. Els paràsits buscats són Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii i filarias, i en veterinària és útil en la recerca de Theileria equi i Babèsia caballi, agents causals de la bebesiosis, especialment en equins.

La coloració de Wright i també la de Giemsa permeten diferenciar els hemoparásitos dels components cel·lulars normals. Per a això es poden utilitzar dos tipus de estesos:

estesos fins

La sang és estesa com una pel·lícula prima sobre un portaobjectes. Es tenyeix amb tinció de Wright, revelant les característiques de l'nucli i de l'citoplasma.

gota grossa

Aquesta metodologia es fa servir per investigar la presència de paràsits en una major quantitat de sang.

Per a això es col·loca sobre un portaobjectes una gota gran de sang. Un cop allà s'ha de desfibrinar, fent cercles cada vegada més grans des del centre cap a fora, utilitzant per a això la vora d'un altre portaobjeto.

Finalment, per a poder observar els paràsits en el frotis gruix dels eritròcits han de ser lisats amb aigua.

infeccions respiratòries

A nivell respiratori aquesta tècnica també és útil, a causa de que les cèl·lules presents en les mostres d'esputs, rentat bronquial o broncoalveolar, són importants per establir el diagnòstic.

Igualment, aquí poden distingir-se les cèl·lules polimorfonuclears i les cèl·lules mononuclears.

bacteriologia

L'ús d'aquesta tècnica en bacteriologia és limitat, pel fet que no és bona per a tenyir als bacteris, és per això que per a la tinció de les mateixes es fan servir altres tècniques de coloració especialitzades.

No obstant això, s'ha emprat per buscar cèl·lules epitelials amb cossos d'inclusió de Chlamydia trachomatis en frotis de mucosa uretral o endocervical, encara que cal reconèixer que no és el millor mètode per a això.

També és possible observar entre els glòbuls vermells bacteris tipus espiral com la Borrelia burgdorferi en pacients infectats, així com mòrules o cossos d'inclusió de Ehrlichia sp en el citoplasma de limfòcits, monòcits o neutròfils en un frotis sanguini.

micologia

L'Histoplasma capsulatum és un fong patogen freqüentment diagnosticat per l'observació microscòpica de diverses mostres de teixits, tenyides amb tinció de Wright.

Com s'observen les estructures de la mostra sanguínia amb la tinció de Wright?

Font: Retamales I, Mall V. Institut de Salut Pública, Govern de Xile. Recomanacions per a la tinció de frotis sanguinis per a la lectura de l'hemograma.

Recomanacions per a una bona tinció

Les extensions de les mostres de sang d'assecar a l'aire espontàniament. Els frotis han de ser el més prims possibles per obtenir una millor fixació de l'colorant i evitar les sobrecoloraciones.

Per tenyits d'alta qualitat, s'aconsella realitzar la tinció durant les dues hores següents a la preparació de l'frotis. D'altra banda, la mostra ideal és sang capil·lar, sense anticoagulant.

No obstant això, si es fa servir sang venosa s'ha d'usar com a anticoagulant EDTA i no heparina, ja que aquest últim pot deformar les estructures cel·lulars.

Per evitar el deteriorament de l'colorant preparat s'ha de guardar en llocs secs.

Durant el procés de el rentat es recomana l'ús d'aigua ajustada a pH neutre.

Finalment, és recomanable fer proves als mètodes tintoriales que s'usen al laboratori de tant en tant.

Això es realitza tenyint mostres o estesos patrons, a manera de control de qualitat. Aquest pas és important, ja que així s'assegura que la tinció està adequadament preparada i els temps de coloració estan ben estandarditzats.

Si la làmina patró queda malament acolorida, llavors hi ha problemes que s'hauran de resoldre.

Errors comuns en la coloració de Wrigth

Tinció molt pàl·lida

Els frotis molt pàl·lids, generalment es deuen a un temps molt curt de tinció o un rentat molt exagerat. Es corregeix allargant el temps de contacte amb el colorant o disminuint el temps de rentat.

Precipitats de el colorant

La presència de precipitats de colorant en el frotis pot tenir diverses causes, però, les causes més freqüents són: ús de l'colorant no filtrat, tenyir sobre ponts de coloració desnivellats, fer servir làmines brutes amb pols o greix, no fer un bon rentat a l' culminar la tinció.

Frotis amb coloració extremadament rogenca o blava

L'amortidor és el responsable de l'pH de l'colorant. Colorants amb pH per sota de l'indicat (àcid) tindran com a conseqüència l'obtenció de frotis molt vermellosos.

Si el pH de l'colorant està per sobre (alcalí) s'obtindrà un frotis extremadament blavós.

Mode d'emmagatzematge

El reactiu s'ha d'emmagatzemar a temperatura ambient.

referències

1. Gutiérrez V. Estudi comparatiu entre el mètode de coloració de Wright i prova d'Elisa per al diagnòstic de Ehrlichiosis canina a la ciutat de San Pedro Sula, Hondures. 2008. Tesi de Grau per optar a l'Títol de Metge Veterinari. Universitat de Sant Carlos de Guatemala.
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Penya S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Les tincions bàsiques en el laboratori de microbiologia. Investigació en Discapacitat. 2014; 3 (1): 10-18.
3. «Tinció de Wright.» Viquipèdia L'enciclopèdia lliure. 18 maig 2018, 00:05 UTC. 8 desembre 2018, 20:37
4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Freqüència de Babèsia spp. en cavalls de munteria, Còrdova (Colòmbia). Rev. udcaactual divulg cient. 2013; 16 (2): 451-458.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Diagnòstic Microbiològic de Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA
6. Retamales I, Mall V. Institut de Salut Pública Govern de Xile. Recomanacions per a la tinció de frotis sanguinis per a la lectura de l'hemograma.