TINCIÓ DE GRAM: FONAMENT, MATERIALS, TÈCNICA I USOS - BIOLOGIA - 2025

La tinció de Gram és la tècnica de coloració més senzilla i més útil en microbiologia diagnòstica. Aquesta tècnica va ser creada pel metge danès Hans Christian Gram en 1884, que va aconseguir classificar als bacteris en Gram positives i Gram negatives, d'acord amb la composició de la paret cel·lular.

La tècnica va patir certes modificacions per Hucker el 1921 per estabilitzar els reactius i millorar la qualitat de la tinció, de manera que la tinció de Gram també es coneix com Gram-Hucker.

Diversos estesos tenyits amb tinció de Gram. A. Cocos Gram positius. B. Bacils Gram negatius. C. Bacils Gram Positius, polimorfonuclears i mononuclears. D. Llevats.

Amb aquesta tècnica també és possible observar la forma que tenen els microorganismes, és a dir, si són cocos, bacils, cocobacilos, pleomórficos, filamentosos, entre d'altres. Així com també la seva distribució en l'espai: en raïm, en cadena, aïllats, en parells, en tètrades, etc.

Quan se sospita una infecció bacteriana, la major part de les mostres rebudes s'han d'estendre en làmina portaobjectes i tenyir-se amb Gram per examinar-se sota el microscopi.

El reporti de l'Gram s'orientarà a el metge sobre quin tipus de microorganisme pot ser la causa de la infecció, abans d'obtenir el resultat definitiu de l'cultiu.

En alguns casos la vida d'el pacient està molt compromesa, per tant els metges necessiten amb urgència el reporti de l'Gram per posar un tractament empíric, mentre esperen la identificació de l'microorganisme.

Per exemple, si el Gram revela que hi ha cocos Gram positius en el líquid cefaloraquidi, el metge orientarà la teràpia inicial amb antibiòtics que eliminin a aquest tipus de bacteris, d'acord amb els protocols establerts per a això.

Quan arribi el resultat definitiu amb el nom de l'microorganisme aïllat i el seu respectiu antibiograma, el metge avaluarà si ha o no canviar la teràpia. Aquesta decisió la prendrà d'acord a l'estudi de susceptibilitat de l'microorganisme davant els antibiòtics que està rebent i l'evolució de l'pacient.

fonament

Aquesta és una tècnica que presenta 4 passos fonamentals: tinció, fixació amb el mordent, decoloració i contratinción. Per tant, aquesta tècnica a més de pintar als bacteris, també permet diferenciar-les.

El cristall violeta és el primer colorant utilitzat. El mateix té afinitat pel peptidoglicà i tenyirà de morat a tots els bacteris presents, posteriorment es col·loca el lugol, que actua com a mordent, és a dir, induirà a la formació de complexos insolubles de vidre violeta-iode - proteïnes ribonucleares dins de la cèl·lula.

Els bacteris Gram positives, a l'tenir una paret gruixuda de peptidoglicà, formen més complexos (cristall violeta-iode), per tant retenen el colorant.

A més també influeix que la paret dels bacteris Gram positives contenen major quantitat d'àcids no saturats, els quals mostren gran afinitat pels agents oxidants (Lugol).

Mentrestant, els bacteris Gram negatives posseeixen una capa prima de peptidoglicà, el que fa que els bacteris formin menys complexos que les Gram positives.

Posteriorment ve el pas de la decoloració, on els bacteris Gram positives i Gram negatives es comporten de manera diferent.

Els bacteris Gram negatives contenen una membrana externa rica en lipopolisacàrids que forma part de la seva paret cel·lular. Els greixos són destruïdes pel contacte amb l'alcohol acetona, de manera que la membrana externa es desestabilitza, sent alliberat el cristall violeta.

És així com després és contrateñida amb la safranina o fucsina bàsica, prenent el color vermell.

En el cas dels bacteris Gram positives, resisteixen la decoloració perquè el decolorant actua tancant els porus, el que impedeix que el complex cristall violeta / iode pugui sortir.

Per tant, es manté estable la coloració amb el cristall violeta, i no hi ha cabuda per a la safranina o la fucsina. Per això aquests bacteris es tenyeixen de blau intens o morat.

materials

El set de coloració de Gram està compost per:

• cristall violeta
• lugol
• Alcohol acetona
• Safranina o fucsina bàsica

Preparació dels colorants i reactius

Solució cristall violeta

Solució A:

Cristall violeta ------------- 2 g

Alcohol etílic 95% ----------- 20cc

Solució B:

Oxalat de amoni ----------- 0.8 gr

Aigua destil·lada ------------- 80 cc

Per a la preparació final de l'cristall violeta s'ha de diluir la solució A 01:10 amb aigua destil·lada i barrejar amb 4 parts de la solució B. Es emmagatzema la barreja durant 24 hores abans de fer-la servir. Es filtra en un flascó per tinció color ambre usant un filtre de paper.

La quantitat que es va a utilitzar diàriament es trasllada a un flascó ambre amb degotador.

Iode-Lugol

Pesar i mesurar la quantitat indicada de cada compost, tal com segueix:

Cristalls de Iode ------------- 1gr

Iodur de potassi ------------- 2gr

Aigua destil·lada ------------- 300 cc

Es dissol el iodur de potassi a poc a poc en l'aigua i posteriorment es agredeixi el iode. Es raslada la solució a un flascó color ambre.

La quantitat que es va a utilitzar diàriament es trasllada a un flascó ambre més petit amb degotador.

decolorant

Alcohol etílic a l'95% ------------ 50 ml

Acetona ------------------ 50 ml

Es prepara a parts iguals. Tapar bé, ja que tendeix a evaporar-se.

Col · locar en flascó amb goter.

Aquesta preparació proporciona una decoloració en temps moderat 5-10 seg i és la més recomanada.

Els principiants prefereixen usar només alcohol etílic a l'95%, on la decoloració és més lenta de 10 a 30 segons.

Mentre que els més experimentats poden usar acetona pura, on la decoloració passa molt ràpidament d'1 a 5 seg.

contrast

Solució mare de safranina

Safranina -------------- 2.5 gr

Alcohol etílic 95% --------- 100 cc

Després de pesar la quantitat indicada de safranina es dissol en 100 cc d'alcohol etílic al 95%.

A partir de la solució mare es prepara la solució de safranina de treball.

Per a això, mesurar 10 cc de la solució mare, afegir 90 cc d'aigua destil·lada per completar 100 ml.

Es recomana traspassar la quantitat que es va a utilitzar diàriament a un flascó ambre amb degotador.

Els microorganismes que es tenyeixen dèbilment de Gram negatius amb la tinció de Gram-Hucker, com certs anaerobis, Legionella sp, Campylobacter sp i Brucella sp, poden tenyir-se molt millor si es fa servir la modificació que va realitzar Kopeloff a la tinció de Gram-Hucker, anomenada tinció de Gram-Kopeloff.

Aquesta tècnica canvia el colorant de safranina per fucsina bàsica. Amb aquesta modificació és possible pintar eficaçment els microorganismes abans esmentats.

Emmagatzematge dels reactius

Els colorants preparats s'han de guardar a temperatura ambient.

Preparació de l'estès de la mostra a pintar

Una mostra ha de contenir com a mínim 10 ⁵ microorganismes abans que sigui probable l'observació de l'microorganisme en un frotis. Els estesos poden realitzar-se de la mostra directament o de cultius en medis sòlids o líquids.

Els estesos han de ser uniformes, ben distribuïts i no molt gruixuts, per a una millor visualització de les estructures presents.

-Gram de mostres directes

Gram d'orina sense centrifugar

Es barreja l'orina i es col·loquen 10 ml en un portaobjectes. L'observació de al menys un bacteri / Camp d'immersió indica que hi ha infecció.

Això vol dir que el cultiu tindrà aproximadament més de 100.000 UFC / ml (10 ⁵ UFC / ml) d'orina en el 85% dels casos.

Aquest mètode no és útil per a recomptes de colònies per sota de 100.000 UFC.

Gram de LCR

S'ha de centrifugar el LCR, es retira el sobrenedant i s'estén el sediment en una làmina portaobjectes. Aquest líquid és estèril en condicions normals; l'observació de bacteris indica infecció.

Gram de mostres respiratòries

El Gram d'esput, rentat bronquial o broncoalveolar, si bé pot haver varietat de microorganismes, sempre orientarà en el diagnòstic, a més de ser útil el tipus de cèl·lules observades.

En el cas d'esputs, s'ha de preparar l'estès amb les porcions més purulentes de la mostra.

Gram d'excrements

No és recomanable fer Gram a aquest tipus de mostres, ja que no té valor diagnòstic.

-Gram de cultius

Poden realitzar-se de dues maneres, un a partir de cultius líquids i una altra a partir de cultius sòlids.

cultius líquids

A partir de cultius líquids és molt senzill; sota l'encenedor es prenen diverses rostides de el brou tèrbol i es col·loquen sobre un portaobjectes net i sec, donant moviments circulars des del centre cap a la perifèria, per distribuir el material uniformement.

Es deixa assecar espontàniament a l'aire. Un cop sec es fixa el material a la làmina amb calor. Per a això, amb ajuda d'una pinça es passa la làmina 3 a 4 vegades per la flama de l'encenedor de Bunsen, amb la cura de no cremar el material.

La làmina es deixa refredar i es col·loca sobre el pont de coloració.

cultius sòlids

Per fer un estès per tinció de Gram a partir d'un cultiu sòlid es procedeix de la següent manera:

Abans de triar les colònies a prendre, s'ha de preparar la làmina portaobjectes, col·locant dues gotes aproximadament de solució salina fisiològica estèril.

Si la placa original de cultiu conté diversos tipus de colònies diferents, es triarà una colònia aïllada de cadascuna per realitzar el Gram. Cada colònia es prendrà amb la nansa de platí per dissoldre-la en la solució salina col·locada prèviament en el portaobjectes.

Es donen moviments circulars des del centre cap a la perifèria, per distribuir homogèniament la colònia en la làmina portaobjectes.

Es deixa assecar espontàniament a l'aire. Un cop sec es fixa la làmina amb calor, com es va explicar anteriorment (flamejant la làmina portaobjectes amb l'encenedor), amb cura de no cremar el material.

Aquest procediment s'ha de realitzar amb cada tipus de colònia diferent. En un paper s'ha d'anotar l'ordre del que observat, per exemple:

Colònia 1: Colònia groga betahemolítica: es van observar cocos Gram positius en raïms

Colònia 2: Colònia color crema, sense hemòlisi: es van observar cocobacilos Gram negatius.

S'ha de retolar cada làmina per saber què estem observant.

tècnica

La tècnica de coloració de Gram és extremadament senzilla de realitzar i relativament econòmica i no pot faltar en un laboratori de microbiologia.

La mateixa es realitza de la següent manera:

1. Fixar el frotis amb calor i col·locar sobre el pont de coloració.
2. Es cobreix la làmina completament amb cristall violeta per 1 minut.
3. Rentar amb aigua. no assecar
4. Cobrir la làmina amb solució de lugol, deixar actuar durant 1 minut. Rentar amb aigua. No assecar.
5. Decolorar per 5-10 segons amb agitació suau en alcohol acetona. O col·locar la làmina en posició vertical i deixar caure gotes de l'decolorant sobre la superfície fins que arrossegui el sobrant de vidre violeta no retingut. No excedir.
6. Rentar amb aigua. No assecar.
7. Tornar a col·locar la làmina sobre el pont de coloració i cobrir per 30 seg amb safranina (Gram-Hucker) o 1 min amb fucsina bàsica (Gram-Kopeloff).
8. Rentar amb aigua
9. Deixar assecar espontàniament a l'aire en posició vertical.

Un cop sec, col·locar 1 gota d'oli d'immersió per observar sota l'objectiu de 100X al microscopi òptic.

utilitat

Aquesta tècnica permet distingir les diferències morfotintoriales de la majoria dels bacteris.

Els llevats també es distingeixen amb aquesta coloració. Elles prenen el cristall violeta, és a dir, es tenyeixen de Gram positiu.

D'altra banda, es poden distingir bacils Gram positius formadors d'espores, en què s'observa un espai clar dins el bacil, on es va formar la endospora, encara que les espores no es tenyeixen bé. Per tenyir espores s'usa altres tècniques com Shaeffer-Fulton.

Cal destacar que aquesta tinció no serveix per pintar tot tipus de bacteris, és a dir, hi ha casos en què la tinció no funciona.

En aquest cas es poden esmentar els bacteris que no tenen paret cel·lular. Per exemple: gènere Mycoplasma, esferoplastos, Ureaplasma, formes L i protoplasts.

A més tenyeix molt mal als bacteris amb parets riques en àcids micòlics, com les mycobacteris ja els bacteris intracel·lulars com clamídies i rickettsies.

Igualment és ineficaç per tenyir a la majoria dels bacteris espiroquetals.

Hi ha bacteris d'un mateix gènere que poden observar-se en la mateixa mostra com Gram positives i com Gram negatives. Quan això succeeix es diu tinció de Gram variable, el que pot ser degut a alteració en nutrients, temperatura, pH o concentració d'electròlits.

errors comuns

descolorir exageradament

Exagerar en el pas de decoloració pot ocasionar l'observació de falsos microorganismes Gram negatius.

No esperar el temps suficient d'assecat per afegir l'oli d'immersió

Pot ocasionar que els bacteris Gram positives es tenyeixin de Gram negatiu (fals Gram negatiu). Això passa perquè en els cultius vells és probable que hi hagi bacteris morts o deteriorades i sota aquestes condicions els bacteris no retenen el cristall violeta.

Utilitzar solució de lugol molt vella:

Amb el temps el lugol va perdent les seves propietats i el seu color es va esvaint. Si s'utilitza el reactiu ja degenerat, aquest no fixarà bé el cristall violeta, per tant hi ha possibilitat d'obtenir una visualització de microorganismes falsament Gram negatius.

fons azuloso

Un fons adequadament descolorit serà vermell. Un fons blau indica que la decoloració va ser insuficient.

referències

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Microbiologia Mèdica, 6 ° edició McGraw-Hill, New York, USA
2. Köneman I, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnòstic Microbiològic. (5ta ed.). Argentina, Editorial Panamericana SA
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnòstic Microbiològic de Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA
4. Cases-Racó G. 1994. Micologia General. 2n Ed. Universitat Central de Veneçuela, Edicions de biblioteca. Veneçuela, Caracas.
5. «Tinció de Gram.» Viquipèdia L'enciclopèdia lliure. 4 oct 2018, 23:40 UTC. 9 desembre 2018, 17:11. Pres de es.wikipedia.org.
6. González M, González N. 2011. Manual de Microbiologia Mèdica. 2a edició, Veneçuela: Direcció de mitjans i publicacions de la Universitat de Carabobo.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Penya S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Les tincions bàsiques en el laboratori de microbiologia. Investigació en Discapacitat. 2014; 3 (1): 10-18.