TINCIÓ DE GIEMSA: FONAMENT, MATERIALS, TÈCNICA I USOS - BIOLOGIA - 2025

La tinció de Giemsa és un tipus de coloració de mostres clíniques, basada en la barreja de colorants àcids i bàsics. La seva creació va estar inspirada pel treball realitzat per Romanowsky, on Gustav Giemsa, químic i bacteriòleg originari d'Alemanya, la va perfeccionar afegint glicerol per estabilitzar els compostos.

Els canvis generats a la tècnica original de Romanowsky van permetre millorar considerablement les observacions microscòpiques, per tant la tècnica va ser batejada amb el nom de tinció de Giemsa.

Diverses mostres tenyides amb Tinció de Giemsa. A. Trypanosoma evansi en sang perifèrica. B. Cèl·lules sanguínies normals. C. Borrelia theileri en sang perifèrica. D. Limfoma de Burkitt.

Per ser una tècnica senzilla de realitzar, de gran funcionalitat i econòmica és actualment molt utilitzada en el laboratori clínic per frotis hematològics, mostres de medul·la òssia i talls de teixit.

La tècnica de tinció de Giemsa és molt útil per a estudis citològics, ja que permet l'observació d'estructures específiques de les cèl·lules. Aquesta tècnica tenyeix els citoplasmes, nuclis, nucléolos, vacúols i grànuls de les cèl·lules, podent-se distingir fins i tot fines traces de cromatina.

A més, es poden detectar canvis significatius en la grandària, forma o coloració de l'nucli, on és possible visualitzar la pèrdua de la relació nucli - citoplasma.

D'altra banda, permet identificar cèl·lules immadures en medul·la òssia i sang perifèrica, sent important per al diagnòstic de malalties greus com la leucèmia. També és possible detectar hemoparásitos, bacteris extra i intracel·lulars, fongs, entre altres.

En citogenètica és bastant utilitzada, ja que és possible estudiar la mitosi de les cèl·lules.

Fonament de la coloració de Giemsa

Els colorants tipus Romanowsky tenen com a fonament utilitzar un contrast entre colorants àcids i bàsics, per aconseguir tenyir les estructures bàsiques i àcides respectivament. Com es pot observar hi ha una afinitat dels colorants àcids a tenyir les estructures bàsiques i viceversa.

El colorant bàsic utilitzat és el blau de metilè i els seus derivats oxidats (Azure A i Azure B), mentre que el colorant àcid és l'eosina.

Les estructures àcides de les cèl·lules són els àcids nucleics, els grànuls dels segmentats basòfils, entre altres, per tant seran tenyits amb el blau de metilè.

En aquest mateix sentit, les estructures bàsiques de les cèl·lules són l'hemoglobina i alguns grànuls com els continguts en els segmentats eosinòfils, entre d'altres; aquests seran tenyits amb l'eosina.

D'altra banda, pel fet que el blau de metilè i el azure es caracteritzen per ser colorants metacromáticos, aquests poden brindar una tonalitat variable a les diferents estructures d'acord a la càrrega de polianiones que posseeixin.

És així com la combinació estratègica de colorants bàsics i àcids aconsegueixen desenvolupar una ampli espectre de colors, d'acord amb les característiques bioquímiques de cada estructura, passejant-se per tonalitats blaves pàl·lides, blaus fosques, lila i porpra en el cas de les estructures àcides.

Mentre que la coloració que brinda l'eosina és més estable, generant colors entre vermellós- taronja i salmó.

materials

Materials per a la preparació de la solució mare

La preparació de la solució mare requereix tot 600 mg de colorant Giemsa en pols, mesurar 500 cc d'alcohol metílic lliure d'acetona i 50 cc de glicerina neutra.

Mode de preparació de la solució mare

Posar la pols de Giemsa pesat en un morter. Si hi ha grumolls s'han de polvoritzar. Posteriorment afegir una quantitat apreciable de la glicerina mesura i barrejar molt bé. La barreja obtinguda s'aboca a un flascó color ambre molt net.

La resta de la glicerina es col·loca en el morter. Tornar a barrejar per netejar la resta de colorant que hagi quedat enganxat a les parets de l'morter i fer fora el mateix flascó.

El flascó es tapa i es porta durant 2 hores en bany maria a 55 ºC. Mentre es trobi en bany de maria, realitzar lleugeres agitacions de la barreja cada mitja hora aproximadament.

Posteriorment, es deixa refredar la barreja per col·locar l'alcohol. Prèviament, una part de l'alcohol mesurat es col·loca en el morter per acabar de rentar el que quedi de colorant i seguidament s'addiciona a la mescla al costat de la resta de l'alcohol.

Aquesta preparació s'ha de deixar madurar durant al menys 2 setmanes. La porció que es vagi utilitzant de la solució mare ha de ser filtrada.

Per evitar la contaminació de l'preparat, es recomana passar la porció que va a estar en constant ús a un flascó ambre petit amb degotador. Recarregar cada vegada que s'esgoti el reactiu.

Materials per preparar la solució Buffer

D'altra banda, es prepara una solució buffer a pH 7,2 de la següent manera:

Es pesen 6,77 g de fosfat de sodi (anhidre) (NaHPO ₄), 2,59 g de fosfat dihidrogen de potassi (KH ₂ PO ₄) i aigua destil·lada fins a 1000 cc.

Preparació final de l'colorant

Per a la preparació de la solució final de tinció es mesuren 2 cc de la solució mare filtrada i es barregen amb 6 cc de la solució buffer. S'agita la mescla.

Una dada rellevant que cal tenir en compte, és que les tècniques de preparació de l'colorant poden canviar segons la casa comercial.

Materials addicionals necessaris per realitzar la coloració

A part dels materials descrits, s'ha de disposar de ponts de coloració, pisetas amb aigua o buffer per al rentat, làmines porta objectes o cobreix objectes, un cronòmetre per controlar els temps de coloració i paper secant o algun material que serveixi per assecar (gasa o cotó).

tècnica

Procés de tinció

1) Previ a la coloració s'ha de tenir a punt l'estès de la mostra sobre un portaobjectes net.

Les mostres poden ser sang, medul·la òssia, talls de teixits histològics o mostres cervico-vaginal. Es recomana que els estesos siguin fins i tinguin 1 o 2 hores d'assecat abans de pintar-los.

2) Sobre un pont de coloració es col·loquen totes les làmines que es tinguin per pintar. Es treballa sempre en un mateix ordre i s'identifica bé cada làmina.

3) Col · locar unes gotes d'alcohol metílic a el 100% (metanol) sobre el frotis i deixar actuar per 3 a 5 minuts, per tal de fixar i deshidratar la mostra.

4) Descartar el metanol present en la làmina i deixar assecar a l'aire.

5) Un cop sec col·locar amb un degotador la solució final de tinció fins a cobrir la totalitat de la làmina. Deixar actuar per 15 minuts. Alguns autors recomanen fins a 25 min. Depèn de la casa comercial.

6) Escórrer el colorant i rentar el frotis amb aigua destil·lada o amb solució buffer a 7,2.

7) Sobre un paper assecant deixar assecar les làmines a l'aire lliure, disposades en forma vertical amb ajuda d'un suport.

8) Netejar el dors de l'portaobjectes amb una gasa o cotó humitejat en alcohol per eliminar qualsevol resta de colorant.

utilitats

La tècnica de tinció de Giemsa és utilitzada en diverses àrees, entre elles: en hematologia, micologia, bacteriologia, parasitologia, citologia i citogenètica.

Hematologia

És la utilitat més freqüent que se li dóna a aquesta tinció. Amb ella s'aconsegueixen identificar totes i cadascuna de les cèl·lules presents en mostres de medul·la òssia o sang perifèrica. Així com estimar el nombre de cada sèrie, podent-se detectar leucocitosi o leucopènia, trombocitopènia, etc.

A causa de que és sensible per identificar cèl·lules immadures, és rellevant en el diagnòstic de leucèmies agudes o cròniques. També és possible fer el diagnòstic d'anèmies, com l'anèmia drepanocítica, falciforme, entre d'altres.

micologia

En aquesta àrea és comú la seva utilització per a la recerca de Histoplasma capsulatum (fong dimórfico intracel·lular) en mostres de teixits.

bacteriologia

En frotis hematològics tenyits amb Giemsa és possible detectar borrèlies sp en pacients que cursen amb la malaltia anomenada febre recurrentis. Les espiroquetes s'observen abundants entre els eritròcits, en mostres preses en el pic febril.

També és possible visualitzar bacteris intracel·lulars com rickèttsies sp i Chlamydia trachomatis en cèl·lules infectades.

Parasitologia

En el camp de la parasitologia, la tinció de Giemsa ha permès fer el diagnòstic de malalties parasitàries com ara la malària, el mal de Chagas i la leishmaniosi.

En les dues primeres els paràsits Plasmodium sp i el Trypanosoma cruzi respectivament poden visualitzar-se en sang perifèrica dels pacients infectats, els mateixos poden trobar-se en diversos estadis segons la fase en què estigui la malaltia.

Per millorar la recerca de paràsits en sang es recomana usar la tinció de Giemsa barrejat amb el colorant de Mai-Grünwald.

Així mateix, la leishmaniosi cutània pot diagnosticar a l'avaluar mostres de biòpsies de pell tenyides amb Giemsa, on hi ha el paràsit.

citologia

La tinció de Giemsa també és usada per a l'estudi citològic de mostres endocervicals, encara que no sigui la tècnica més freqüentment utilitzada per a aquesta finalitat.

Però en casos d'escassetat de recursos pot emprar-se, tenint una funcionalitat similar a la que ofereix la tècnica de Papanicolau ia un menor cost. No obstant això, requereix d'expertesa per part de l'examinand.

citogenètica

Una característica rellevant de la tinció de Giemsa és la seva capacitat per unir-se fortament a les regions riques en adenines i timines de l'ADN. Això permet que l'ADN pugui ser visualitzat durant la mitosi de les cèl·lules, en diferents estats de condensació.

Aquests estudis són necessaris per detectar aberracions cromàtiques com ara duplicacions, delecions o translocacions de les diferents regions dels cromosomes.

Investigacions que demostren l'eficàcia de la tinció de Giemsa

CanNova i cols (2016), van comparar 3 tècniques de coloració per al diagnòstic de leishmaniosi cutània.

Per a això, van utilitzar mostres obtingudes d'un animal d'experimentació (Mesocrisetus auratus) inoculat experimentalment amb leishmànies.

Els autors van demostrar que la tinció de Giemsa va ser millor que la coloració de Pap-mart® i Gaffney. Per tant, van considerar que la coloració de Giemsa és la ideal per a diagnosticar la leishmaniosi cutània.

Els excel·lents resultats obtinguts pels autors es deuen al fet que la combinació de colorants que componen la barreja de Giemsa presenta les condicions necessàries per crear un contrast favorable, permetent distingir clarament les estructures dels amastigotes, tant intra com extracelularmente.

Les altres tècniques (Pap-mart® i Gaffney) també ho van fer, però d'una manera més feble i per tant més difícil de visualitzar. És per això que la coloració de Giemsa es recomana per al diagnòstic parasitològic de leishmaniosi.

Així mateix, un estudi de Ramírez i cols (1994), va avaluar la validesa de les tincions de Giemsa i Lendrum en frotis conjuntivals per a la identificació de Chlamydia trachomatis.

Els autors van determinar que la tinció de Giemsa i Ledrum posseeixen igual especificitat, però Giemsa va resultar ser més sensible.

Això explica perquè en l'actualitat la tinció de Giemsa és la més freqüentment utilitzada per al diagnòstic d'infeccions per clamídies, especialment si hi ha pocs recursos.

Font: Panreac Applichem ITW Reagents. Tinció de Giemsa. Versió 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar de Vallès, Espanya.

Recomanacions per a una bona tinció

No s'ha d'accelerar l'assecat de les làmines. S'ha d'esperar el temps prudencial per a l'assecat de la mateixa a l'aire lliure. Aproximadament 2 hores.

Pintar immediatament passades les 2 hores per millors resultats.

Perquè els frotis es fixin i es tenyeixin millor la mostra ha de ser distribuïda sobre la làmina de tal manera que quedi una capa prima i uniforme.

La mostra de sang preferida és la capil·lar, ja que el frotis es fa de manera directa de la gota de sang i per tant la mostra no porta additiu, la qual cosa afavoreix el manteniment de les estructures cel·lulars.

No obstant això, si es fa servir sang venosa s'ha d'usar EDTA com anticoagulant i no heparina, ja que aquest últim en general deforma les cèl·lules.

Errors comuns en la coloració de Giemsa

A la pràctica d'aquesta coloració es poden cometre errors. Els mateixos s'evidencien per canvis bruscos en les tonalitats de les estructures.

Coloració extremadament blau

Es pot deure a:

• Frotis molt gruixuts
• Excedir en el temps de tinció
• Rentar de forma insuficient.
• Ús de reactius molt per sobre de l'pH neutre (alcalí).

Sota aquestes condicions els colors de les següents estructures es distorsionen, de tal manera que els eritròcits en comptes de tenyir-se de rosa-salmó es veuran verds, els grànuls dels eosinòfils que han de tenyir-se de vermell maó es tornaran blaus o grisos i així successivament haurà desviació en les tonalitats habituals.

Coloració excessivament rosada

Pot ser degut a:

• Temps de tinció insuficient.
• Rentat prolongat o excessiu.
• Mal assecat.
• Ocupació de reactius molt àcids.

En aquest cas en particular, les estructures que normalment es tenyeixen de blau no seran gairebé visibles, mentre que les estructures que es tenyeixen de rosa tindran tonalitats molt exagerades.

Exemple: els eritròcits prendran un color vermell brillant o ataronjat fort, la cromatina nuclear es veurà rosa pàl·lida i els grànuls dels eosinòfils es tenyiran de vermell brillant intens.

Presència de precipitats en el frotis

Les causes poden ser:

• Utilitza làmines brutes o mal rentades.
• No deixar assecar bé el frotis.
• Deixar la solució fixadora per massa temps.
• Rentats inadequats a l'concloure la tinció.
• Filtració inadequada o no filtració de l'colorant que s'està utilitzant.

Presència d'artefactes morfològics

En els frotis poden aparèixer artefactes morfològics que dificulten la visualització i interpretació de les estructures presents. Això es deu a:

• Tipus d'anticoagulant emprat, com l'heparina.
• Ús de làmines brutes, deteriorades o greixoses.

Mode d'emmagatzematge

Després d'preparat el colorant s'ha de mantenir a temperatura ambient (15 - 25 ° C), per evitar que el colorant precipiti. Ha d'emmagatzemar en envàs ambre ben tancat.

referències

1. CanNova D, Brito E i Simons M. Avaluació de tècniques de coloracions per al diagnòstic de la Leishmaniasis cutània. Salus. 2016; 20 (2): 24-29.
2. Panreac Applichem ITW Reagents. Tinció de Giemsa. Versió 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar de Vallès, Espanya.
3. Clark G. Staining procedures (1981), 4thed. Williams & Willkins.
4. Química Clínica Aplicada. Colorant Giemsa per a diagnòstic in vitro. Distribuïdor: cromakit.es
5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F i Grazioso C. Validesa de les tincions de Giemsa i Lendrum en frotis conjuntivals per a la identificació de Chlamydia trachomatis. Bol of Sanit Panamà. 1994; 116 (3): 212-216.
6. Cases-Racó G. Micologia General. 1994. 2n Ed. Universitat Central de Veneçuela, Edicions de biblioteca. Veneçuela, Caracas.
7. «Tinció de Giemsa.» Viquipèdia L'enciclopèdia lliure. 1 Set 2017, 01:02 UTC. 6 desembre 2018, es.wikipedia.org.