TINCIÓ D'ESPORES: FONAMENT, TÈCNIQUES I USOS - BIOLOGIA - 2025

La tinció d'espores és la metodologia usada per pintar les estructures de resistència que formen alguns gèneres bacterians quan es troben en condicions desfavorables; aquestes estructures corresponen a una forma de supervivència.

Hi ha molts gèneres que formen espores; però, els principals són Bacillus i Clostridium. Aquests gèneres es consideren més rellevants pel fet que posseeixen espècies patògenes per a l'ésser humà.

Tinció d'espores pel mètode de Shaeffer-Fulton o Wirtz-Conklin. I tambe (original uploader), from Wikimedia Commons

Cada bacil pot donar origen a una espora. A l'hora de tenyir la preparació, l'espora es pot trobar dins de l'bacil (endòspora) o fora d'aquest (exospora). Amb les tècniques de coloració convencionals per bacteris -com la tinció de Gram les espores queden incolores.

En l'actualitat es compten amb diverses metodologies de coloració que són capaços de travessar la gruixuda estructura de l'espora per tenyir. Aquestes metodologies són molt variades; entre aquestes es poden esmentar la tècnica de Dorner, la tinció de Möeller i la metodologia de Shaeffer-Fulton, també coneguda com Wirtz-Conklin.

De totes les tècniques esmentades, la metodologia de Shaeffer-Fulton és la més utilitzada en els laboratoris de rutina. Deu el seu nom a dos microbiòlegs que van crear la coloració en 1930: Alicia Shaeffer i MacDonald Fulton. No obstant això, de vegades la tècnica és anomenada Wirtz-Conklin en honor a dues bacteriòlegs dels anys 1900.

fonament

Les espores no es tenyeixen amb les coloracions convencionals pel fet que posseeixen una paret molt gruixuda. La complexa composició de les espores impedeix l'entrada de la majoria dels colorants.

Si s'estudia l'espora de fora cap a dins s'observen les següents capes: en primer lloc hi ha el exosporium, que és la capa més fina i externa formada per glicoproteïnes.

Després ve la cutícula, que brinda resistència a les altes temperatures, seguida de l'escorça composta per peptidoglicà. Posteriorment hi ha la paret de la base que protegeix el protoplast.

L'espora és una estructura deshidratada que conté un 15% de calci i àcid dipicolínico. Per això, la majoria de les tècniques de coloració d'espores es basen en l'aplicació de calor perquè el colorant pugui penetrar la gruixuda estructura.

Una vegada que l'espora es tenyeix, aquesta no pot eliminar a el colorant. En la tècnica de Shaeffer-Fulton el verd de malaquita entra a les cèl·lules vegetatives i, a l'aplicar la calor, penetra a la endospora i també en les exosporas.

A l'rentar amb aigua, el colorant s'elimina de la cèl·lula vegetativa. Això passa perquè el tint verd de malaquita és lleugerament bàsic, de manera que s'uneix feblement a la cèl·lula vegetativa.

En canvi, no pot sortir-se de l'espora i finalment es contratiñe el bacil amb safranina. Aquest fonament és vàlid per a la resta de les tècniques, en les que passa una cosa semblant.

Tècniques de coloració d'espores

Per realitzar la tinció d'espores s'ha de tenir un cultiu pur del cep sospitosa que es vol estudiar.

El cultiu es sotmet a temperatures extremes durant 24 hores per estimular el microorganisme a esporular. Per a això es pot col·locar el cultiu en una estufa a 44 ° C o en nevera (8 ° C) durant 24 o 48 hores.

Si es deixa massa temps a les temperatures esmentades, només s'han d'observar exosporas, perquè ja totes les endòspores hauran sortit de l'bacil.

Culminat el temps s'han de col·locar unes gotes de solució fisiològica estèril sobre un portaobjectes net. Després es pren una petita porció de l'cultiu i es realitza un estès fi.

Posteriorment es deixa assecar, es fixa a la calor i es tenyeix amb alguna de les tècniques que s'expliquen a continuació:

Tècnica de Dorner

1- Preparar en un tub d'assaig una suspensió concentrada de l'microorganisme esporulado en aigua destil·lada i afegir un volum igual de fucsina fenicada de Kinyoun filtrada.

2- Col·locar el tub en un bany amb aigua en ebullició durant entre 5 i 10 minuts.

3- Sobre un portaobjectes net barrejar una gota de la suspensió anterior amb una gota de solució aquosa de nigrosina a l'10%, bullida i filtrada.

4- Estendre i eixugar ràpidament amb calor suau.

5- Examinar amb objectiu de 100X (immersió).

Les espores es tenyeixen de color vermell i les cèl·lules bacterianes apareixen gairebé incolores contra un fons gris fosc.

Tècnica de Dorner modificada

1- Es fa un estès d'una suspensió de l'microorganisme esporulado en un portaobjectes i es fixa a la calor.

2- mostra es cobreix amb una tira de paper de filtre a la qual se li afegeix fucsina fenicada. El colorant s'escalfa de 5 a 7 minuts amb la flama de l'encenedor de Bunsen fins que es generi el despreniment de vapors. Després es retira el paper.

3- Es renta la preparació amb aigua i després s'asseca amb paper absorbent.

4- Es cobreix el frotis amb una pel·lícula prima de nigrosina a l'10%, usant un segon portaobjeto per estendre la nigrosina o una agulla.

La coloració que prenen les espores i els bacteris és igual a la descrita en la tècnica anterior.

Tècnica de Shaeffer-Fulton o Wirtz-Conklin

1- Fer un estès fi amb una suspensió de l'microorganisme esporulado en un portaobjectes i fixar a la calor.

2- Cobrir el portaobjectes amb solució aquosa de verd de malaquita a el 5% (es pot posar un paper de filtre sobre la làmina).

3- Escalfar sobre la flama de l'encenedor de Bunsen fins a causar despreniment de vapors i retirar la flama. Repetir l'operació durant de 6 a 10 minuts. Si durant el procediment s'evapora massa la solució de verd de malaquita, es pot afegir més.

4- Retirar el paper de filtre (si va ser col·locat) i rentar amb aigua.

5- Cobrir el portaobjectes amb safranina aquosa a l'0,5% durant 30 segons (algunes variants de la tècnica usen safranina aquosa a l'0,1% i la deixen per 3 minuts).

Amb aquesta tècnica les espores es presenten de color verd i els bacils de color vermell.

Té l'inconvenient que les endòspores de cultius joves no es tenyeixen bé, atès que es veuen extremadament clares o incolores. Per evitar això es recomana usar cultius de 48 hores d'incubació.

Tècnica de Möeller

1- Cobrir el frotis amb cloroform per 2 minuts.

2- Descartar el cloroform.

3- Cobrir amb àcid cròmic a el 5% durant 5 minuts.

4- Rentar amb aigua destil·lada

5- Es cobreix la làmina amb carbol fucsina-fenicada i s'exposa a la flama de l'encenedor de Bunsen fins a l'emissió de vapors; després es retira de la flama uns instants. Es repeteix l'operació fins a complir 10 minuts.

6- Rentar amb aigua.

7- Utilitza etanol acidificat (alcohol clorhídric) per descolorir. Es deixa durant 20 o 30 segons.

8- Rentar amb aigua destil·lada.

9- Contrateñir cobrint la làmina amb blau de metilè per 5 minuts.

10- Rentar amb aigua destil·lada.

11- Es deixa assecar i es porta la mostra a l'microscopi.

Les espores es veuen de color vermell i els bacils blaus. És important no aspirar els vapors, ja que són tòxics ia llarg termini poden ser cancerígens.

Tècnica de Möeller modificada sense calor

L'any 2007 Hayama i els seus col·laboradors van crear una modificació de la tècnica de Möeller. Van eliminar el pas de l'escalfament de l'colorant i el van substituir per l'addició de 2 gotes de l'surfactant tergitol 7 per cada 10 ml de solució de carbol fucsina-fenicada. Es van obtenir els mateixos resultats.

usos

La coloració d'espores brinda una informació molt valuosa i útil per a la identificació de l'patogen, ja que la presència de la mateixa, la seva forma, ubicació dins del bacil i la capacitat de deformar la cèl·lula vegetativa o no, són dades que poden orientar sobre l'espècie involucrada dins d'un determinat gènere.

En aquest context, val a dir que les espores poden ser rodones o ovalades, poden estar ubicades al centre o també en posició paracentral, subterminal o terminal.

Esquema de la forma i posició de les endòspores i exosporas

exemples

- Clostridium difficile forma una espora oval en posició terminal que deforma el bacil.

- L'espora de Clostridium tertium és oval, no deforma a l'bacil i se situa a nivell terminal.

- La endospora de Clostridium tetani és terminal i deforma a l'bacil, donant l'aspecte d'un escuradents de tambor.

- Les espores de Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. Novy i C. septicum són rodones o ovals subterminales i deformen a l'bacil.

- La endospora de Clostridium Sordelli se situa en la posició central, amb una lleu deformació.

Köneman I, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnòstic Microbiològic. (5ta ed.). Argentina, Editorial Panamericana SA

referències

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Proposal of a simplified technique for staining bacterial Spores without applying heat-successful modification of Moeller 's method. Eur J Med Res. 2007; Desembre 16 (8): 356-9.
2. Wikipedia contributors. Moeller stain. Viquipèdia The Free Encyclopedia. November 3, 2018, 03:28 UTC. Disponible a: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Manual de Laboratori de Tècniques Microbiològiques. Departament de Ciències Bàsiques Acadèmia de Microbiologia. Institut Politècnic Nacional.
4. «Endospora.» Viquipèdia L'enciclopèdia lliure. 25 feb 2018, 10:20 UTC. 10 gen 2019, 02:42: es.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bé C, Torres J, Rico M, Macías J i col·laboradors. (2006). Personal laboral de la comunitat autònoma d'Extremadura. Temari específic Volum IV. Editorial MAD. Sevilla-Espanya, pp 211-212.
6. Silva M, García M, Corrals J, Ponce I. (2006).Tècnic especialista en laboratori, de el Servei Gallec de Salut (SERGAS). Temari matèria específiques volum 2. Editorial MAD. Sevilla-Espanya, pp 79-80.
7. Köneman I, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnòstic Microbiològic. (5ta ed.). Argentina, Editorial Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnòstic Microbiològic de Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA