TINCIÓ DE CÀPSULA: FONAMENT I TÈCNIQUES - BIOLOGIA - 2025

La tinció de càpsula és una tècnica de coloració diferencial que té la propietat de ressaltar l'estructura polisacàrida que envolta certs bacteris i llevats denominada càpsula. S'utilitza en els laboratoris clínics per ajudar a la diagnosi de certes patologies originades per microorganismes capsulados.

També s'utilitza en laboratoris de docència per a la demostració d'aquesta estructura morfològica a estudiants de carreres de ciències de la salut, com ara: medicina, bioanàlisi, infermeria, o citotecnología, entre d'altres.

Frotis de Klebsiella pneumoniae tenyit amb tinció de càpsula. Mètode de tinta índia amb safranina. Font: А.А.В

Hi ha diverses tècniques senzilles per demostrar la presència de la càpsula en els microorganismes que la posseeixen, aquestes són: la tinció negativa, la tinció de Anthony i una variant que combina les dues anteriors.

La tinció negativa s'utilitza principalment en mostres de LCR quan se sospita la presència del llevat Cryptococcus neoformans. Aquest llevat és una causa freqüent de meningitis.

Aquesta tècnica utilitza nigrosina o tinta xinesa i es fonamenta en crear un contrast entre el fons de l'preparat i la càpsula impenetrable de l'microorganisme. El fons es tenyeix de fosc i la càpsula queda incolora. D'aquesta manera es posa en evidència aquesta estructura.

Pel que fa a la tècnica d'Anthony es pot dir que és majorment utilitzada en laboratoris de docència per demostrar l'estructura polisacàrida en bacteris com Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae i Neisseria meningitidis.

L'ús d'aquesta tècnica per a fins diagnòstics és molt poc freqüent, ja que hi ha altres proves de rutina que permeten identificar aquests microorganismes.

fonament

La càpsula és una estructura forta de naturalesa polisacàrida. Aquesta protegeix els microorganismes de la fagocitosi, i per tant és una estructura difícil de penetrar.

És per això que les tincions de càpsules es fonamenten en el contrast. Els colorants tenyeixen el fons de la preparació mentre que la càpsula queda incolora.

Per tant, amb aquestes tècniques la càpsula és fàcilment recognoscible. Si el microorganisme no posseeix càpsula no serà distingible amb aquest tipus de coloració, perquè tot es tenyirà de el mateix color.

Totes les tècniques que s'utilitzen per a pintar la càpsula posseeixen el mateix fonament tot i que utilitzen colorants i procediments diferents.

tècniques parell

-Tinción d'Anthony

La tinció d'Anthony utilitza com a colorant a l'cristall violeta. Aquest tenyirà el cos bacterià i el fons de color violeta.

D'altra banda, s'utilitza sulfat de coure a l'20%. Aquest serveix de solució de rentat, és a dir, treu l'excés de vidre violeta de la preparació, fent que les càpsules s'aclareixin però sense que el cos bacterià ni el fons perdin el color.

materials

- Llet tornassolada.

- Làmina portaobjeto.

- Cristall violeta a l'1%.

- Sulfat de coure a l'20%.

- Microscopi òptic.

- Oli d'immersió.

procediment

Aquesta tècnica consisteix en:

1. Cultivar el microorganisme en llet tornassolada per 36 hores.
2. Posar una gota d'el cultiu a l'extrem d'una làmina porta objectes i a la banda col·locar una gota de vidre violeta, barrejar i estendre amb l'extrem d'un altre portaobjectes.
3. Assecar a l'aire lliure i no fixar a la calor.
4. Rentar amb solució de sulfat de coure a l'20%, deixar assecar a l'aire lliure.
5. Observar a l'microscopi amb objectiu d'immersió. Cerca cap als extrems de l'estesa.

És important no utilitzar calor ni per fixar, ni per assecar, ja que això danya la càpsula. Tampoc rentar amb aigua.

interpretació

La llet tornassolada és un excel·lent mitjà de cultiu ja que proporciona els nutrients necessaris perquè el microorganisme desenvolupi una càpsula prominent.

D'altra banda, la llet tornassolada formarà un fons gruixut i compacte que es tenyirà de violeta juntament amb el cos bacterià, però la càpsula que envolta el microorganisme quedarà incolora. Per tant, s'observa un halo clar al voltant de el cos bacterià.

Representació gràfica sobre l'observació microscòpica d'un frotis de Klebsiella pneumoniae tenyit amb la tinció d'Anthony. Font: Realitzat per l'autora MSc. Marielsa Gil.

avantatges

És una tècnica senzilla de realitzar. No requereix fixació.

Així mateix, cal destacar que es poden usar altres mitjans de cultiu, però es prefereix el mitjà amb llet perquè té l'avantatge que proporciona càpsules més prominents.

desavantatges

És una tècnica una mica més laboriosa que la tinció negativa, i per a la seva visualització requereix esperar que la preparació s'assequi completament.

-Tinción negativa

materials

- Làmines portaobjectes.

- Medi de cultiu amb el microorganisme.

- Tinta Xina o nigrosina.

- Microscopi òptic.

- Solució salina fisiològica.

procediment

Posar una gota de solució salina fisiològica sobre el cobreobjectes i dissoldre una petita porció de l'cultiu microbià. És important que la preparació no quedi molt gruixuda. Després col·locar una gota de tinta Xina o nigrosina i barrejar.

Després es col·loca una làmina cobreobjectes sobre la preparació sense que se sobrepasse el líquid. S'observa a l'microscopi enfocant primer a objectiu de 10X i després es passa a 40X.

Aquesta tècnica també es pot usar sobre mostres de LCR de forma directa. És a dir, en comptes de posar una gota de cultiu microbià es col·loca una gota de LCR.

avantatges

És un mètode senzill de realitzar i alhora econòmic. No requereix fixació, ni assecat de la preparació.

desavantatges

Té com a desavantatge que ha d'observar a l'microscopi abans que la preparació s'assequi, doncs si això passa els microorganismes es contrauran, el que dificultarà la visualització.

D'altra banda, es poden presentar falsos positius si l'analista és inexpert, ja que els leucòcits solen confondre amb els llevats.

L'observació de llevats amb càpsula amb la tècnica de tinta Xina o nigrosina ha de ser considerat com un diagnòstic presumptiu de Cryptococcus neoformans fins que sigui demostrat amb el cultiu.

Això es deu al fet que hi ha altres llevats que poguessin ser la causa de la meningitis i no només el Cryptococcus neoformans, com ara les de l'gènere Candida i Rhodotorula, així com altres espècies de Cryptococcus.

interpretació

Si hi ha microorganismes capsulados s'observarà un fons fosc, amb cossos transparents surant en el líquid, posant-se en evidència la presència de la càpsula.

Càpsula de Cryptococcus neoformans tenyit amb tinta Xina. Font: Photo Credit: Content Providers (s): CDC / Dr. Leanor Haley

-Tècnica de tinta índia

Aquesta tècnica també es pot realitzar amb nigrosina. És una combinació de les tècniques anteriorment explicades. Aquesta tècnica utilitza cristall violeta i tinta índia o nigrosina.

El cos bacterià pren el color porpra de l'cristall violeta a causa que està carregat negativament, mentre que la nigrosina acoloreix el fons de l'frotis. Si el bacteri té càpsula, aquesta es veurà com un halo transparent al voltant de l'microorganisme.

El cristall violeta pot ser substituït per qualsevol d'aquestes coloracions: safranina, fucsina bàsica o blau de metilè.

materials

- Cristall violeta.

- nigrosina o tinta Índia.

- Làmines portaobjectes.

- Microscopi.

procediment

- Conrear el microorganisme en un mitjà de cultiu.

- Posar una gota de el cultiu a l'extrem d'una làmina portaobjectes i al costat col·locar una gota de vidre tinta índia o nigrosina, barrejar i estendre amb l'extrem d'un altre portaobjeto.

- Assecar a l'aire i no fixar a la calor.

- Cobrir amb una solució de cristall violeta per 1 minut, rentar amb aigua destil·lada però amb molta delicadesa (raig suau), deixar assecar a l'aire lliure.

- Observar a l'microscopi amb objectiu d'immersió. Cerca cap als extrems de l'estesa.

interpretació

S'observarà un cos bacterià color violeta i un fons fosc. La càpsula, si està present, es veurà incolora voltant del bacteri.

referències

1. Covadonga A, Silóniz M, Serrano S. Tècniques bàsiques de Microbiologia. Observació de bacteris. Reduca (Biologia). Sèrie Microbiologia. 2010; 3 (5): 15-38. D
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Penya S, Cerón-González G, Franco-Cendejas R. Les tincions bàsiques en el laboratori de microbiologia. Mediagraphic.org. 2014; 3 (1): 10-18. Disponible a: medigraphic.com
3. Gil M. Tinció negativa: fonament, tècnica, avantatges i desavantatges. Lifeder.com.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnòstic Microbiològic de Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA
5. Tankeshwar A. Capsule Stain: Principle, Procedure and Results. 2019. Medical Microbiology Guide. Disponible in: microbeonline.com