- fonament
- Fonament de el test Voges-Proskauer
- Fonament de l'revelat de la prova i interpretació
- preparació
- Medi RM / VP
- Reactiu Voges A
- Reactiu Voges B
- Procediment de el test Voges-Proskauer
- Revelat de la prova
- ús
- Control de qualitat
- referències
El test Voges-Proskauer és una prova bioquímica que s'utilitza per ajudar a la identificació de bacteris pertanyents a la família Enterobacteriaceae. Especialment és útil per diferenciar soques d'Escherichia coli de Klebsiella i Enterobacter, entre d'altres.
La prova es realitza en el medi de cultiu líquid anomenat vermell de metil-Voges Proskauer, millor conegut amb les sigles RM / VP. Aquest mitjà està compost per polipeptona tamponada, glucosa, fosfat dipotàssic i aigua destil·lada.
Medi comercial Vermell de Metil-Voges Proskauer (RM / VP) / Test VP positiva i negativa respectivament. Font: Fotografia presa per l'autora MSc. Marielsa Gil / Sudipta.nov15, from Wikimedia Commons
El mitjà actual RM / VP és una modificació de l'mig Clark i Lubs, el qual originalment contenia menor concentració de peptones i glucosa. Per tant, es produïa menys quantitat de l'ió hidrogen, requerit per la reacció positiva de Voges-Proskauer.
El test es fonamenta en la capacitat que té el microorganisme d'utilitzar la glucosa per la via butilén-glicólica, i formar un producte final neutre denominat acetoína, en presència d'oxigen i d'un pH alcalí.
Al mig RM / VP, a més de poder-se revelar el test de Voges-Proskauer, també es pot revelar la prova de vermell de metil.
fonament
Fonament de el test Voges-Proskauer
Les pluripeptonas presents en el medi proporcionen els requeriments nutricionals indispensables per al creixement bacterià. Per la seva banda, la glucosa és el compost principal. Molts bacteris tenen la capacitat de metabolitzar la glucosa i formar àcid pirúvic.
L'àcid pirúvic és un punt mitjà en el metabolisme de la glucosa ia partir d'allà cada microorganisme pot prendre diferents vies. Alguns formaran àcids mixtes, com ara àcid làctic, àcid acètic, àcid fòrmic i àcid succínic, i altres formessin productes neutres com el 2,3-butanediol.
El test Voges-Proskauer revela la capacitat de l'microorganisme de formar acetil metil carbinol (acetoína), producte intermediari de l'2,3-butanediol en condicions de aerobiosi.
La acetoína es redueix i forma 2,3-butanediol, però aquesta reacció és reversible, per tant si el 2,3-butanediol s'oxida es forma acetoína. Per això, l'oxigen és indispensable.
El fosfat dipotàssic és el buffer que esmorteeix la barreja a un pH 6,9 ± 0,2.
Fonament de l'revelat de la prova i interpretació
Per evidenciar la reacció s'ha de realitzar un revelat utilitzant dos reactius (reactius de Barrit), coneguts com Voges A i Voges B.
El Voges A és una solució a el 5% de α-naftol, i el Voges B és un preparat d'hidròxid de potassi a l'40%. Si no es disposa d'hidròxid de potassi pot ser substituït per hidròxid de sodi a l'40%.
L'α-naftol és un catalitzador que augmentarà la intensitat de la color de la reacció, el que fa a la prova més sensible. L'α-naftol ha d'agregar sempre primer, agitant el tub perquè el medi entri en contacte amb l'oxigen. D'aquesta manera la acetoína present s'oxida a diacetil, i el 2,3-butanediol s'oxida per formar acetoína, passant aquesta a diacetil.
És així com el α-naftol s'unirà a l'diacetil, que al seu torn s'ha unit a l'nucli guanidina present en l'aminoàcid arginina, aquesta última provinent de les pluripeptonas.
Per la seva banda, l'hidròxid de potassi o de sodi s'encarrega d'absorbir el CO 2 i de reaccionar amb les peptones. Aquesta reacció origina la formació d'un color rosat-salmó, clarament visible després d'agitar molt bé el tub.
Perquè la coloració es produeixi instantàniament s'han de barrejar quantitats correctes de diacetil, peptona i α-naftol. Si això no passa es deixa reposar el tub durant 15 minuts abans d'interpretar.
Generalment la prova dóna positiva després de 2 a 5 minuts, quan es pot observar un color rosat feble. Si es deixa en repòs durant 30 min a 1 hora la intensitat del color serà màxima (vermell intens).
Una prova negativa es posarà en evidència quan el brou quedi de color groc. Després d'1 hora, si la prova és negativa, es pot formar un color rogenc producte de la reacció de l'hidròxid de potassi sobre el α-naftol.
preparació
Medi RM / VP
Pesar 17 g de el mitjà de cultiu deshidratat i dissoldre en un litre d'aigua destil·lada. Deixar reposar per 5 minuts. Escalfar fins ebullició per dissoldre completament. Servir 3 a 4 ml en tubs i esterilitzar en autoclau a 121 ° C per 15 minuts.
El medi de cultiu deshidratat és de color beix i el medi preparat és de color ambre clar.
El pH final de l'mitjà és de 6,9 ± 0,2.
Reactiu Voges A
Pesar 5 gr de α-naftol i dissoldre en 50 ml d'alcohol etílic (absolut). Posteriorment seguir afegint alcohol etílic fins a enrasar a 100 ml.
Reactiu Voges B
Pesar 40 gr d'hidròxid de potassi i dissoldre en 50 ml d'aigua destil·lada en un Beaker. El got s'ha de col·locar en un bany d'aigua freda per controlar la temperatura, a causa que a l'hora de dissoldre la preparació puja de temperatura bruscament.
Després que la solució estigui freda es transvasa a una pilota aforat i s'enrasa a 100 ml amb aigua destil·lada.
Procediment de el test Voges-Proskauer
Per fer el test de Voges-Proskauer s'inocula un brou RM / VP amb el microorganisme en estudi, a partir d'un cultiu pur de 18 a 24 hores.
El inòcul no ha de ser molt dens. Es incuba a 35-37 ° C per 24 a 48 hores, encara que en ocasions és necessària la incubació per diversos dies. Cowan i Steel opinen que 5 dies és el temps mínim d'incubació necessari per detectar totes les espècies Voges-Proskauer (VP) positiu de la família Enterobacteriaceae.
Revelat de la prova
Separar una alíquota d'1 ml en un tub i realitzar el revelat de la següent manera: col·loqui 12 gotes (0,6 ml) de l'reactiu Voges A i 4 gotes (0,2 ml) de Voges B. Barregi per airejar i deixeu reposar per 5 - 10 minuts abans d'interpretar. No obstant això, si la prova encara està negativa deixi reposar i observi el tub a el cap de 30 minuts a 1 hora.
L'aparició d'un color rosat-vermell indica que la reacció Voges-Proskauer és positiva. Si el mitjà es queda groc la reacció és negativa.
L'addició dels reveladors en l'ordre i quantitat indicada és fonamental per evitar falsos negatius.
ús
La prova de Voges-Proskauer és útil per diferenciar entre soques d'E coli que són VP negatius, dels gèneres Klebsiella, Enterobacter, Serratia, entre altres, que són VP positius.
Font: Köneman I, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnòstic Microbiològic. 5ta ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
Control de qualitat
Per provar la qualitat de l'mig preparat es poden usar ceps controls, entre elles Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700.603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium i Enterobacter cloacae ATCC 13047.
Els resultats esperats són reaccions Voges-Proskauer positives únicament per K. pneumoniae i E. cloacae. La resta donen reaccions negatives.
referències
- Laboratoris Britània. MR-VP Mitjà. 2015. Disponible a: www.britanialab.com
- Laboratoris Microkit. M-Ident Voges Proskauer. 2014. Disponible:
- Mac Faddin J. (2003). Proves bioquímiques per a la identificació de bacteris d'importància clínica. 3era ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnòstic Microbiològic de Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
- Köneman I, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnòstic Microbiològic. 5ta ed. Editorial Panamericana SA Argentina.