SEQÜENCIACIÓ DE L'ADN: MAXAM-GILBERT, MÈTODE I EXEMPLES - BIOLOGIA - 2025

La seqüenciació d'ADN (àcid desoxiribonucleic) és un procediment realitzat en laboratoris de biologia molecular que permet conèixer l'ordre de nucleòtids en el material genètic d'interès. A més, la seqüenciació de l'ARN (àcid ribonucleic) també pot ser develada.

Aquesta tècnica ha estat indispensable per al desenvolupament de les ciències biològiques. També és aplicable a altres camps de coneixement - com el diagnòstic mèdic i les investigacions forenses, per exemple.

Font: pixabay.com

Anteriorment, la seqüenciació d'un bri d'ADN era considerat com una activitat lenta i costosa, que permetia la identificació de només uns pocs parells de bases en els oligonucleòtids.

Avui dia, amb tots els avenços de la ciència, la seqüenciació d'ADN és una operació de rutina en molts laboratoris a nivell mundial gràcies a la contribució de gairebé 50 anys d'investigació en aquest camp. Pel que fa a la longitud de la cadena, es poden seqüenciar fins a milions de parells de bases en molt poc temps.

Per fer-ho, hi ha desenes de tècniques desenvolupades que varien quant al seu preu i la seva precisió. En aquest article, descriurem tant les tècniques clàssiques i les modernes, cadascuna amb els seus avantatges i desavantatges.

Fins ara, les tècniques de seqüenciació permeten obtenir la seqüència de genomes complets, des de petits procariotes i llevats fins el genoma humà.

Estructura de l'ADN

Per entendre els mètodes i tècniques usats per a la seqüenciació d'ADN, cal conèixer certs aspectes claus de l'estructura i composició de la molècula.

L'ADN és una biomolècula que es troba en tots els éssers vius, des dels bacteris fins als grans animals aquàtics. Les organel·les - com mitocòndries i cloroplasts - posseeixen una molècula d'ADN circular al seu interior. Fins en alguns virus, el material genètic trobat és ADN.

Estructuralment, l'ADN és un conjunt de nucléotidos. Cada un es troba integrat per un glúcid, una base nitrogenada (A, T, C o G) i un grup fosfat. L'objectiu de la seqüenciació de l'ADN és desvetllar l'ordre en què es troben les quatre bases nitrogenades en la seqüència.

història

A mitjans dels anys cinquanta, els investigadors Watson i Crick van descriure l'estructura de l'ADN usant tècniques cristolográficas. Tanmateix, cap d'aquests investigadors havia pogut trobar la manera de desvetllar la seqüència.

Encara que van existir certs antecessors, l'esdeveniment més important va ser la creació d'el mètode de Sanger, l'any 1977. Frederick Sanger, el pare de l'mètode, va anar un bioquímic britànic, guanyador de dos premis Nobel per les seves enormes contribucions a les ciències biològiques.

A aquesta tècnica també se li coneix en la literatura com "terminació de cadena" o dels dideoxinucleótidos. A continuació es descriurà els principis d'aquesta tècnica i de les que es van desenvolupar partint de l'perfeccionament i innovació d'aquesta.

Mètode de Sanger

El desenvolupament de l'mètode de Sanger va representar un esdeveniment crucial en la biologia molecular. Involucra els components bàsics de l'procés de replicació de l'ADN que normalment ocorre en la cèl·lula, però afegint un component especial: els dideoxinucleótidos.

Components principals de la reacció

- ADN polimerasa: l'enzim ADN polimerasa és un elements crucial de el procés. Aquesta molècula participa en la replicació del bri d'ADN i el seu paper és la síntesi de la nova cadena, aparellant els desoxiribonucleòtids trifosfat amb els complementaris.

Recordem que en l'ADN les timines (T) s'aparellen amb les adenines (A) per mitjà de dos ponts d'hidrogen, mentre que la citosina (C) ho fa amb la guanina (G) per tres ponts.

- Nucleòtids: la seqüenciació de Sanger involucra dos tipus de nucleòtids, els quatre 2'-deoxinucleótidos (abreujats com dATP, dGTP, dCTP i dTTP) i els quatre dideoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP i ddTTP) especials.

Tot i que els dideoxinucleótidos són similars als monòmers que normalment són incorporades a l'ADN, aquests no tenen un grup -OH en la seva estructura. Això impossibilita l'addició d'un nou nucleòtid a la cadena.

Per això, quan un nucleòtid especial és afegit - de manera totalment aleatòria - a la cadena en formació, la síntesi es paralitza. D'aquesta manera, a l'acabar la reacció, es tenen cadenes de diferents dimensions, cadascuna on la reacció va ser parada en un punt diferent.

Experimentalment, es preparen quatre assaigs. Cada un conté l'ADN extret de la mostra biològica d'interès, els nucleòtids normals i un dels quatre tipus de nucleòtids especials. O bé es marquen els nucleòtids especials amb algun tipus de marcador fluorescent (veure més endavant seqüenciació automatitzada).

Lectura dels resultats

El primer pas és separar cadascuna de les cadenes sintetitzades segons la seva grandària. Algunes seran més llargues que altres, depenent de el lloc on van ser incorporades les bases especials.

Hi ha diferents tècniques bioquímiques que permeten la separació dels components d'una mescla fent servir com a propietat discriminatòria la mida. En el mètode de Sanger, les diferents cadenes són separades per electroforesi. En les variants més sofisticades de la tècnica, s'usa electroforesi capil·lar.

Així, els brins més llargues es desplacen menys que les variants més curtes. Després, aquest sistema passa per un lector que reconeix el marcador inclòs en cada dideoxinucleótidos. D'aquesta manera, es pot conèixer l'ordre de la seqüència.

Aquesta tècnica de "primera generació" és capaç de llegir fragments d'ADN no majors a 1 kilobase. En l'actualitat, el mètode de Sanger és emprat en diversos laboratoris, generalment en les seves variants modernes. A més que és usat per corroborar els resultats obtinguts amb les tècniques més complexes - però menys precises.

seqüenciació automàtica

Quan cal seqüenciar a gran escala, el procés s'accelera mitjançant l'automatització. Aquest és una variació de mètode de terminació de cadena de Sanger, on els encebadors es troben marcats amb productes fluorescents per poder distingir-los.

Posteriorment, el producte de la reacció és corregut en una electroforesi - tot en un sol carril. Quan cada fragment surt de la porció final de el gel, és identificat ràpidament per la seva marcatge fluorescent, amb un error que envolta l'1%.

Els sistemes més sofisticats disposen d'un sistema de fins a 96 tubs capil·lars manejat per un ordinador acoblada a un robot. És a dir, es poden avaluar de manera simultània 96 mostres d'ADN. Així, s'automatitza per complet el procés que involucra l'electroforesi i l'anàlisi dels resultats.

En un dia, aquests sistemes poden seqüenciar fins 550.000 bases. Durant el procés, el treball humà és innecessari, només es requereixen uns 15 minuts a l'començar el mètode.

Seqüenciació de Maxam-Gilbert

A el mateix temps que Sanger va publicar el seu treball, dos investigadors anomenats Allan Maxan i Walter Gilbert van aconseguir desenvolupar un altre mètode per obtenir la seqüència d'ADN. El mètode va guanyar popularitat en el moment, però després va ser desplaçat pel millorament de l'mètode de Sanger.

Contràriament al mètode de Sanger, la seqüenciació de Maxan i Gilbert (o seqüenciació química, com també se li coneix) no involucra reaccions d'hibridació. La metodologia consisteix en el marcatge amb agents reactius en un dels extrems, seguit d'un procés de purificació.

Un dels aspectes negatius d'aquesta tècnica rau en la seva enorme complexitat i en l'ús de químics que són perillosos per a l'usuari. Les ruptures químiques s'indueixen mitjançant l'aplicació de DMS, àcid fòrmic, hidrazina i hidrazina amb sals.

procediment

El protocol s'inicia amb el marcatge a l'extrem 5 del fil amb el marcador fòsfor 32, després ocorre una modificació química de la base nitrogenada i aquesta se separa. Finalment passa l'escissió de la regió abásica.

Primer s'escurça la cadena que es vol seqüenciar en segments més petits. Aquest pas es realitza amb enzims de restricció, que donen com a resultat extrems excel·lents.

Seguidament, es procedeix a la reacció amb una fosfatasa alcalina, amb la finalitat eliminar el grup fosfat. Així, pot ser usada una quinasa polinucleótido per realitzar el marcatge.

La cadena es desnaturalitza (s'obren els dos brins). Després es procedeix a aplicar els químics. Aquestes reaccions d'escissió es fan de manera controlada i es coneixen quins tipus d'enllaços trenca cada químic aplicat.

Lectura dels resultats

Com en el mètode de Sanger, la lectura dels resultats involucra la separació per grandària de les cadenes obtingudes en un sistema d'electroforesi. Els sistemes compostos per poliacrilamida permeten obtenir una resolució molt adequada per a la lectura de el gel.

seqüenciació massiva

La seqüenciació massiva engloba una sèrie de mètodes nous, abreujats com NGS, de l'anglès "Next Generation Sequencing".

Els mètodes catalogats com NGS requereixen d'un pas previ d'amplificació de l'ADN (no treballen amb una sola molècula). A més, les plataformes usades varien àmpliament. A continuació es descriuran els principis dels mètodes més populars:

piroseqüenciació

Implica el seguiment de l'alliberament d'un pirofosfat, que passa cada vegada que s'afegeix un nou nucleòtid en el bri d'ADN. S'acobla un sistema d'enzims, perquè passi l'emissió de llum (que és detectable per una càmera) cada vegada que s'incorpora un nou nucleòtid.

El procés comença amb la incubació separada de cada base nitrogenada per verificar si hi ha o no emissió de llum. La piroseqüenciació pot fer la lectura de llargues fibres, però la taxa d'error trobada és alta.

Seqüenciació per síntesi

Aquesta involucra la incorporació de nucleòtids marcats. S'afegeixen aquests components fluorescents, es renten, i s'anota el nucleòtid incorporat. Després, s'elimina el marcatge de l'nucleòtid, i la síntesi del bri pot continuar. En el següent pas, també s'incorporarà un nucleòtid marcat, i es repetiran els passos esmentats.

Un inconvenient per aquesta tècnica passa quan no són eliminats per complet els marcadors fluorescents. Aquestes emissions creen errors de fons, traduint-se en errors significatius.

Seqüenciació per lligació

Aquesta tècnica varia dels altres, ja que no fa servir l'ADN polimerasa. En el seu lloc, l'enzim clau per a aquesta metodologia és la ligasa. Aquí es fan servir fragments d'ADN marcats de manera fluorescent, és lligat per l'enzim i és detectat.

El major problema amb aquesta tècnica és la longitud tan curta de fragment que és capaç de processar.

Seqüenciació Ió Torrent

Aquesta tècnica es basa en el mesurament de l'ió H ⁺ que és alliberat cada vegada que s'incorpora un nou nucleòtid. El principi és bastant similar a la piroseqüenciació, però molt més econòmic.

exemples

La seqüenciació de l'genoma humà

Seqüenciar el genoma dels humans ha estat un dels reptes més prometedors de la biologia, a més de ser una de les rivalitats més aclamades en la història de la ciència. De fet, per als científics involucrats en el projecte, seqüenciar el genoma es va convertir en una competència.

L'any 1990 inicia el que es va anomenar "projecte genoma humà", dirigit pel famós científic, guanyador de el premi Nobel, James Watson. Passat un any, el 1991, Venter assumeix el repte de "guanyar-lo" a Watson i seqüenciar el genoma abans que ell. No obstant això, l'any 1992, Watson es va retirar i el comandament ho va prendre un altre investigador.

Al 1995 Venter va anunciar el seu èxit en la seqüenciació completa d'un genoma bacterià pel mètode de seqüenciació aleatòria. De la mateixa manera, l'equip contrari va anunciar un any després la seqüenciació de l'genoma del llevat.

L'any 2000 es va donar per acabada la cursa. Les dues companyies van publicar els seus resultats preliminars de l'genoma complet en dues de les revistes més prestigioses de la ciència: Nature i Science.

No obstant això, els científics van seguir treballant en millorar les propostes, i el 2006 es van acabar les seqüències certs cromosomes humans.

Importància i aplicacions

Conèixer l'ordre dels nucleòtids d'una molècula tan important com l'ADN és valuós per als biòlegs i professionals afins. Aquesta cadena de polinucleòtids conté tota la informació necessària per al desenvolupament i el manteniment de totes les formes de vida.

Per aquestes raons, el coneixement d'aquesta seqüència és imprescindible per a la investigació biològica. Fonamentalment, la seqüenciació permet mesurar una de les propietats més importants dels sistemes biològics i poder establir diferències entre ells.

La seqüenciació és àmpliament usada pels taxònoms i sistemàtics, ja que certes seqüències d'ADN permeten establir criteris per a concloure si dos organismes pertanyen o no a les mateixa espècie, a més de poder proposar hipòtesis sobre les relacions filogenètiques entre ells.

A més, la seqüenciació d'ADN té aplicacions en l'àmbit de la medicina i en el diagnòstic. Per exemple, hi ha sistemes econòmics i accessibles que mitjançant seqüenciació permeten avaluar la tendència a desenvolupar certes malalties (com el càncer) usant els anomenats polimorfismes nucleòtids simples (SNP).

Les investigacions de l'tipus criminalístiques i forenses també s'han enriquit amb les tècniques de seqüenciació, podent usar-se com a evidència fidedigna de la participació de cert individu en un crim.

referències

1. Heather, JM, & Chain, B. (2016). The sequence of sequencers: the history of sequencing DNA. Genomics, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK, & Mardis, ER (2013). The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell, 155 (1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Rivalitats científiques. De Galileu a el projecte genoma humà. Editorial Paranimf.
4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, AR (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences, 74 (12), 5463-5467.
5. Schuster, SC (2007). Next-generation sequencing transforms today 's biology. Nature methods, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (Ed.). (2014). Next-generation Sequencing. Caister Academic Press.