PROTEINASA K: CARACTERÍSTIQUES, ACTIVITAT ENZIMÀTICA, APLICACIONS - BIOLOGIA - 2025

La proteïnasa K és un enzim que pertany a el grup de les proteases de serina, és a dir, posseeix en el seu centre catalític actiu un aminoàcid serina i té la funció de trencar els enllaços peptídics per hidròlisi. Al seu torn aquest enzim pertany a la família de les proteïnes subtilisinas (peptidasa S8).

La proteïnasa K posseeix un pes molecular (PM) de 28.900 daltons i va ser aïllada per primera vegada en 1.974 en extractes de l'fong Engyodontium àlbum, anteriorment conegut amb el nom de Tritirachium àlbum Limber.

Estructura molecular de la proteinasa K. Font: Lykchiniadis

Presenta una alta capacitat proteolítica, demostrada a l'ésser capaç de degradar la queratina present en el cabell. La paraula queratina en anglès s'escriu "Keratin", d'allí prové que hagi estat anomenada "proteïnasa K".

Pel seu alt poder d'escindir proteïnes natives, aquest enzim és útil en diverses tècniques de biologia molecular. Principalment es fa servir per aïllar i preparar àcids nucleics amb pes molecular (PM) alt.

La proteïnasa K actua alliberant l'ADN nuclear, mentre destrueix a les proteïnes i inactiva a les RNases i les DNasas, és a dir, elimina a les nucleases en les preparacions d'ADN i ARN.

D'altra banda, s'ha vist que la proteïnasa K pot hidrolitzar algunes proteïnes natives desnaturalitzades, el que ha fet despertar l'interès dels investigadors per a la seva utilització en l'estudi de les proteïnes priòniques (PrPC).

No obstant això, malgrat la seva alta potència proteolítica existeixen proteïnes que són resistents a l'acció de la proteinasa K. Entre elles, es troben algunes proteïnes anòmales anomenades prions (PrPSc), associades amb encefalopaties espongiformes transmissibles.

Característiques de la proteinasa K

La proteïnasa K posseeix una estructura terciària conformada per tres capes, amb una làmina β de set cadenes immiscuïdes entre dues capes d'hèlixs. Per pertànyer a la família de les peptidasas S8 es caracteritza per presentar al seu lloc actiu una triada catalítica, l'ordre seqüencial és (Asp, His i Ser), la qual cosa les diferencia d'altres famílies de peptidasas.

Aquest enzim del grup de les proteases de serina, es caracteritza per hidrolitzar els enllaços peptídics propers a el grup carboxílic dels aminoàcids alifàtics i aromàtics.

D'altra banda, és capaç d'actuar en presència de certes substàncies corrosives, com ara dodecilsulfat sòdic (SDS), Tris-HCL i EDTA, els quals es fan servir per ajudar a la desnaturalització de les proteïnes, fent que perdin la seva estructura nativa.

Aquest és un pas previ a la preparació de proteïnes per a la tècnica d'electroforesi. El rang de pH a el qual actua la proteïnasa K és bastant ampli (2.0 a 12.0), amb un pH òptim entre 7.5 a 12.0, i el seu punt isoelèctric és de 8.9. Com es pot observar és activa enfront d'un rang molt ampli de pH.

Una altra característica que ressalta en la proteïnasa K és la seva estabilitat en presència d'altes temperatures (50 - 60 ° C).

activitat enzimàtica

La proteïnasa K necessita la presència de l'ió calci, si bé aquest no afecta la seva activitat, si és indispensable per mantenir la seva estabilitat.

Perquè la proteïnasa K realitzi la digestió completa de l'substrat és necessari un temps de contacte aproximat entre 5 minuts fins a 2 hores.

No obstant això, en aquest sentit Daza i col·laboradors van comparar la puresa de l'ADN obtingut a diversos temps d'exposició davant de la proteïnasa K, i van arribar a la conclusió que una incubació perllongada (fins a 24 h) millora significativament la qualitat de l'ADN.

Ara bé, en relació a la concentració que s'utilitza de l'enzim proteinasa K en els diferents protocols, es pot dir que és molt variada.

Es pot utilitzar des concentracions molt baixes (5 mg / ml) fins a concentracions de 500 mg / ml. Però les concentracions de treball més freqüents oscil·len entre 50-100μg / ml, especialment per a la digestió de proteïnes i inactivació de nucleases. Encara que per al tractament de teixits es requereix una concentració de 2 mg / ml.

aplicacions

Les seves aplicacions són molt àmplies i es poden resumir en les següents:

-Es fa servir en la digestió de proteïnes i extracció d'ADN per diversos mètodes com són: salting-out, PK-SDS, bromur de cetil-trimetil amoni (CTAB), acetat de potassi modificat i extracció amb iodur de sodi.

-Inactivación de nucleases (RNases i les DNasas).

-A la tècnica d'hibridació in situ (HIS), per ajudar a l'alliberament de l'àcid nucleic, a més d'eliminar proteïnes indesitjables.

-Modificació de proteïnes.

-A nivell de recerca, en estudis diversos.

Avantatges de la proteinasa K

S'han realitzat diversos estudis comparatius entre tècniques d'extracció d'ADN que fan servir proteïnasa K, amb altres que no la utilitzen i tots conclouen que hi ha més beneficis quan s'usa l'enzim. Entre els avantatges es poden esmentar les següents:

-Es obté ADN d'alt pes molecular, d'alta qualitat i puresa.

-El ADN extret és estable fins per 3 mesos.

L'ADN extret pot ser utilitzat en les següents tècniques: Southern blot, reacció en cadena de la polimerasa (PCR), electroforesi, entre d'altres.

Proteïnes resistents a la proteïnasa K

Diverses investigacions han conclòs que els prions (proteïnes anòmales PrPSc tòxica) es diferencien de les proteïnes PrPC (natives) per ser resistent a l'acció de la proteinasa K, mentre que les PrPC són sensibles a la seva acció.

Altres autors han descrit que en l'estructura de les PrPSc existeixen porcions sensibles i altres resistents a la proteïnasa K. No obstant això, les dues parts són igual de tòxiques i infectants.

D'altra banda, Bastian i col·laboradors en 1987 van aïllar abril proteïnes de 28, 30, 66 i 76 kDa provinents d'una espècie de Spiroplasma mirum. Totes van resultar ser resistents a l'acció de la proteinasa K ia més van tenir reacció creuada amb alguns prions.

Se sap que aquesta espècie pot causar cataractes i danys neurològics importants i causa de les troballes científiques de Bastian, entre d'altres investigacions, s'ha tractat de relacionar a aquest microorganisme amb les encefalopaties espongiformes transmissibles.

No obstant això, l'etiologia d'aquesta patologia neurològica degenerativa segueix sent atribuïda a l'actualitat als prions.

En aquest sentit, Butler i col·laboradors en 1991 van identificar i caracteritzar una classe de proteïna resistent a la proteïnasa K de 40 kDa provinent de dues soques de Mycoplasma hyorhinis. Aquest patogen afecta els porcs, infectant els seus teixits, però en aquest cas no hi va haver reacció creuada amb els prions provats.

Calen més investigacions per dilucidar moltes incògnites a l'respecte.

referències

1. Bastian F, Jennings R, and Gardner W. 1987. Antiserum to scrapie-associated fibril protein cross-reacts with Spiroplasma miru m fibril proteins. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, Rei J, Ruiz V. Avaluació d'un mètode d'extracció i purificació de DNA a partir de teixit muscular fixat en formaldehid de cadàvers no identificats. Revista Med, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge I, And Mcgarrity G. Identification and Characterization of Proteinase K-Resistant Proteins in Members of the Class Mollicutes. Infection and Immunity, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Comparació de dos protocols d'extracció d'ADN de Trypanosoma cruzi cultivats al mig axénico. Rev. Perú. Med. Exp. Salut Pública 2014; 31 (2): 222-227. Disponible a: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez I i Palma W. Determinació de l'efectivitat de cinc protocols d'extracció d'ADN a partir de material parafinat per a estudis moleculars. Rev Méd Univ Costa Rica. 2007; 1 (1): 10-19.