DAPI (4 ', 6-DIAMIDINO-2-FENILINDOL): CARACTERÍSTIQUES, FONAMENT, ÚS - QUIMICA - 2025

El DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) és un colorant que per la seva propietat fluorescent serveix com a marcador, sent molt utilitzat en la tècnica de microscòpia de fluorescència o citometria de flux, entre d'altres. La fluorescència que emet és de color blau brillant, la seva excitació es produeix entre 455-461 nm (llum UV).

El colorant DAPI pot travessar la membrana cel·lular de les cèl·lules mortes amb gran facilitat. També pot tenyir els nuclis de cèl·lules vives, però en aquest cas, la concentració d'aquest ha de ser més gran.

Estructura química de l'colorant fluorescent DAPI. Font: Imatge: File: DAPI.svg is a vector versio of this file. It should be used in place of this raster image when not inferior / Richard Wheeler (Zephyris) Imatge editada

El colorant és capaç d'accedir a l'ADN cel·lular pel qual té una especial afinitat, unint-se amb gran avidesa a les bases nitrogenades adenina i timina. Per aquest motiu és de gran utilitat en algunes tècniques de biologia molecular.

Aquest compost pertany a el grup dels colorants indòlics i ha demostrat tenir major sensibilitat per l'ADN que el bromur d'etidi i el iodur de propidi, especialment sobre gels d'agarosa.

L'ús d'aquest colorant fluorescent és molt ampli, ja que és útil per a: estudiar canvis en l'ADN en els processos apoptòtics (mort cel·lular) i per tant detectar cèl·lules en aquest procés; per a la foto footprinting d'ADN (impressió fotogràfica de l'ADN); per estudiar la contaminació bacteriana; o per visualitzar la segmentació nuclear.

També s'ha utilitzat en l'estudi de bandes cromosòmiques, en la detecció d'ADN de Mycoplasmas sp, en la interacció DNA-proteïna, en la tinció i comptatge de cèl·lules per immunofluorescència i inclusivament per pintar grans madurs de pol·len.

Característiques

DAPI és l'abreujament del seu nom químic (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol). La seva fórmula molecular és C ₁₆ H ₁₅ N _5. Posseeix un pes molecular de 350,3. A prop de la franja de llum UV (345-358 nm) passa l'excitació màxima de l'complex DAPI-ADN, mentre que l'emissió de fluorescència màxima ocorre entre 455-461 nm.

Aquest colorant es caracteritza per ser una pols de color groc, però les estructures marcades amb aquest fluoròfor emeten una llum blava brillant.

És un compost soluble en aigua, però, per accelerar la seva dissolució es pot aplicar una mica de calor. Es pot diluir amb PBS però no dissoldre directament en aquest.

Un cop preparat el colorant, aquest ha de ser emmagatzemat en foscor, és a dir, protegit de la llum, a una temperatura de 2 a 8 ° C (nevera). Sota aquestes condicions, el colorant és estable per més de 3 setmanes o mesos.

Si es protegeix de la llum però es deixa a temperatura ambient la seva estabilitat baixa a 2 o 3 setmanes, però exposat a llum directa el deteriorament és molt ràpid. Si es desitja guardar per molt més temps es pot refrigerar a -20 ° C distribuït en alíquotes.

fonament

Aquesta coloració es fonamenta en generar una contratinción nuclear a les principals tècniques de biologia molecular, com ara: citometria de flux, microscòpia de fluorescència i tinció de cromosomes metafàsics o nuclis interfàsics, entre d'altres.

Aquesta tècnica es basa en la gran afinitat que té el colorant per les bases nitrogenades (adenina i timina) contingudes en el material genètic (ADN) en el solc menor. Mentre que a nivell citoplasmàtic deixa molt poc fons.

Quan ocorre la unió de l'colorant fluorescent a les regions d'adenina i timina de l'ADN, la fluorescència augmenta significativament (20 vegades més). El color que emet és blau brillant. Cal destacar que no hi ha emissió de fluorescència quan s'uneix als parells de bases GC (guanina-citosina).

És important ressaltar que tot i que també té afinitat per l'ARN, aquesta no causa problema, pel fet que el major grau d'emissió d'energia d'aquesta molècula passa a una altra longitud d'ona (500 nm), a diferència de l'ADN que ho fa a 460 nm. A més l'augment de fluorescència un cop unit a l'ARN és de només 20%.

El DAPI s'usa més per tenyir cèl·lules mortes (fixades) que vives, ja que per tenyir a aquestes últimes es necessita una concentració molt més alta de l'colorant, això es deu al fet que la membrana cel·lular és molt menys permeable a l'DAPI quan està viva.

El colorant DAPI es pot usar en combinació amb fluoròfors vermells i verds per així obtenir una experiència multicolor.

ús

El DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) és un excel·lent fluoròfor i per tant és àmpliament utilitzat en diverses tècniques i per a diversos propòsits. A continuació s'explica l'ús de DAPI en les principals tècniques.

Citometria de flux

Els investigadors Gohde, Schumann i Zante el 1978 van ser els primers a utilitzar i proposar el DAPI com fluoròfor en la tècnica de citometria de flux, tenint un gran èxit per la seva alta sensibilitat per l'ADN i la seva alta intensitat en l'emissió de fluorescència.

L'ús d'DAPI en aquesta tècnica, permet l'estudi de l'cicle cel·lular, la quantificació de cèl·lules i la tinció de cèl·lules vives i mortes.

Encara que existeixen altres colorants, com ara el bromur d'etidi, l'òxid de Hoechst, el taronja de l'acridina i el iodur de propidi, el DAPI és un dels més utilitzats per ser més fotoestable que els anteriorment esmentats.

Per a aquesta tècnica es requereix fixar les cèl·lules, per a això pot usar-se etanol absolut o paraformaldehid a el 4%. La mostra es centrifuga i es rebutja el sobrenedant, posteriorment s'hidraten les cèl·lules addicionant 5 ml de solució amortidora PBS per 15 minuts.

Mentre transcorre el temps prepari el colorant DAPI amb un tampó de tinció (FOXP3 de BioLegend) a una concentració de 3 micres.

Centrifugui la mostra, rebutgi el sobrenedant i posteriorment cobreixi amb 1 ml de solució DAPI per 15 minuts a temperatura ambient.

Portar la mostra a l'citòmetre de flux amb el làser adequat.

Microfluorometría de flux

Una altra tècnica en què s'utilitza el DAPI és a la micro-fluorometria de flux juntament amb un altre fluoròfor anomenat mitramicina. Tots dos són útils per quantificar l'ADN de cloroplast de forma individual, però DAPI és el més indicat per mesurar partícules de bacteriòfags T4.

hibridació

Aquesta tècnica bàsicament utilitza sondes d'ADN marcades amb un colorant fluorescent que pot ser el DAPI.

La mostra requereix ser tractada amb calor per desnaturalitzar l'ADN bicatenari i convertir-la en dues cadenes monocatenàries. Posteriorment s'hibrida amb una sonda d'ADN desnaturalitzat marcat amb DAPI que posseeix una seqüència d'interès.

Posteriorment es renta per eliminar el que no es va hibridar, s'utilitza un contrast per visualitzar l'ADN. El microscopi de fluorescència, permet l'observació de la sonda hibridada.

Aquesta tècnica té la finalitat de detectar seqüències específiques en l'ADN cromosòmic, podent fer el diagnòstic de determinades malalties.

Aquestes tècniques cito-moleculars han estat de gran ajuda per determinar detalls en l'estudi dels cariotips. Per exemple, ha evidenciat les regions riques en parells de bases d'adenosina i timina denominades regions heterocromàtiques o bandes DAPI.

Aquesta tècnica és molt utilitzada per a l'estudi de cromosomes i cromatina en plantes i animals, així com també en el diagnòstic de patologies prenatals i hematològiques en l'humà.

En aquesta tècnica, la concentració de DAPI recomanada és de 150 ng / ml per un temps de 15 minuts.

Els portaobjectes ja muntats han de guardar-protegits de la llum a 2-8 ° C.

Tinció d'immunofluorescència

Les cèl·lules es fixen amb paraformaldehid a el 4%. Si es van a utilitzar altres colorants es deixa DAPI a la fin com contratinción i es cobreixen les cèl·lules amb solució PBS per 15 minuts. Mentre transcorre el temps, prepareu la solució DAPI diluint amb PBS, de tal manera que la concentració final sigui 300 micres.

Després s'extreu el PBS sobrant i es cobreix amb DAPI per 5 minuts. Es renta diverses vegades. La làmina s'observa en un microscopi de fluorescència sota el filtre adequat.

Full de seguretat

Aquest compost ha de ser manipulat amb cura, pel fet que és un compost que té propietats mutagèniques. El carbó activat és utilitzat per eliminar a aquest compost de solucions aquoses que van a ser descartades.

S'ha d'utilitzar guants, bata i lents de seguretat per evitar accidents amb aquest reactiu. Si passa contacte amb pell o mucoses de rentar l'àrea amb suficient aigua.

Mai ha de pipetejar aquest reactiu amb la boca, utilitzeu propipetes.

No contamini el reactiu amb agents microbians, ja que això es traduirà en resultats erronis.

No dilueixi el colorant DAPI més del recomanat, perquè disminuirà considerablement la qualitat de la tinció.

No exposi el reactiu a la llum directa, ni conservi en calor perquè això disminueix la fluorescència.

referències

1. Brammer S, Toniazzo C and Poersch L. Corantes comunament empregados na citogenètica vegetal. Arq. Inst. Biol. 2015, 82. Disponible from: Scielo.
2. Laboratoris Impath. DAPI. Disponible a: menarinidiagnostics.com/
3. Laboratoris Cytocell. 2019. Instructions for use of DAPI. available at cytocell.com
4. Elosegi A, Sabater S. Conceptes i tècniques en ecologia fluvial. (2009). Editorial Rubes, Espanya. Disponible a: books.google.co.ve/
5. Novaes R, Penitent A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Ús de fluorescència en un mètode de dissector modificat per estimar el nombre de miòcits en el teixit cardíac. Arq. Bras. Cardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Disponible from: Scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-València P. Presència de fitoplasmes en papayo (Carica papaia) a Mèxic. Revista Chapingo. Sèrie horticultura, 2011; 17 (1), 47-50. Disponible a: scielo.org.