- fonament
- equip
- Tipus d'HPLC
- Cromatografia de fase normal
- Cromatografia de fase inversa
- Cromatografia d'intercanvi iònic
- Cromatografia d'exclusió molecular
- aplicacions
- referències
La cromatografia líquida d'alta eficàcia és una tècnica instrumental utilitzada en anàlisis químiques amb la qual es permet separar mescles, purificar i quantificar-ne els components, així com realitzar altres estudis. Se li coneix amb l'abreviatura HPLC, derivada de l'anglès: High Performance Liquid Chromatography.
Així doncs, com el seu mateix nom assenyala, funciona manipulant líquids. Aquests consisteixen en una barreja composta pel analit o la mostra d'interès, i un o més solvents que actuen com la fase mòbil; és a dir, la que arrossega l'analit per tot l'equip de l'HPLC i la columna.
Equip d'HPLC. Font: Dqwyy
La HPLC es troba àmpliament difosa pels laboratoris d'anàlisi de qualitat en nombroses empreses; com ara les farmacèutiques i la alimentària. L'analista en qüestió ha de preparar la mostra, la fase mòbil, comprovar la temperatura i altres paràmetres, i col·locar els vials dins de la roda o carrusel perquè l'equip faci les injeccions automàticament.
Els equips d'HPLC vénen acoblats a un ordinador mitjançant la qual pot observar-se els cromatogrames generats, així com iniciar les anàlisis, controlar el cabal de la fase mòbil, programar el tipus d'elució (isocrática o per gradient), i encendre els detectors (Uv -Vis o l'espectrofotòmetre de masses).
fonament
A diferència de la cromatografia líquida convencional, com la de el paper o la de la columna farcida amb sílice gel, la HPLC no depèn de la gravetat perquè el líquid mulli la fase estacionària. En el seu lloc, treballa amb bombes d'altes pressions, les quals irriguen la fase mòbil o eluent per la columna amb més intensitat.
D'aquesta manera, no cal abocar la fase mòbil a cada estona per la columna, sinó que el sistema ho fa contínuament i amb cabals més alts.
Però l'eficiència d'aquesta tècnica no es deu exclusivament a aquest detall, sinó també a les diminutes partícules de farciment que conformen la fase estacionària. A l'ésser més petites, la seva àrea de contacte amb la fase mòbil és més gran, de manera que interaccionarà en millor grau amb l'anàlit i es separaran més les seves molècules.
Aquestes dues característiques, més el fet que la tècnica permet l'acoblament de detectors, fan de l'HPLC molt superior a la cromatografia de capa fina o de paper. Les separacions són més eficients, la fase mòbil es desplaça millor a través de la fase estacionària, i els cromatogrames permeten detectar alguna falla en l'anàlisi.
equip
Diagrama simplificat de l'funcionament d'un equip HPLC. Font: Gabriel Bolívar.
A dalt es mostra un diagrama simplificat de com funciona un equip d'HPLC. Els solvents es troben en els seus respectius recipients, disposats amb mànegues perquè la bomba porti un petit volum dels mateixos cap a l'interior de l'equip; tenim així la fase mòbil.
La fase mòbil o eluent ha desgasificarse primer, de tal manera que les bombolles no afectin la separació de les molècules d'analit, el qual es barreja amb la fase mòbil un cop l'equip hagi realitzat les injeccions.
La columna cromatogràfica s'ubica dins un forn que permet regularitzar la temperatura. Així, per a diferents mostres es tenen temperatures adequades per aconseguir separacions d'alt rendiment, així com també es té un ampli catàleg de columnes i tipus de farcits o fases estacionàries per a anàlisi en específics.
La fase mòbil amb l'analit dissolt ingressa a la columna, i d'ella elueixen primer les molècules que "senten" menys afinitat per la fase estacionària, mentre que elueixen després les que són més retingudes per ella. Cada molècula eluida genera un senyal visualitzada en el cromatograma, on s'observen els temps de retenció de les molècules separades.
I d'altra banda, la fase mòbil després de passar pel detector acaba en un recipient de rebuig.
Tipus d'HPLC
Existeixen molts tipus de HPLC, però entre tots ells els més resaltantes són els quatre següents.
Cromatografia de fase normal
La cromatografia de fase normal es refereix a aquella on la fase estacionària és de naturalesa polar, mentre que la mòbil apolar. Encara que se li digui normal, de fet és la menys utilitzada, sent la de la fase inversa la més difosa i eficient.
Cromatografia de fase inversa
A l'tractar-se d'una fase inversa, ara la fase estacionària és apolar i la fase mòbil polar. Això és especialment útil en anàlisis bioquímiques, ja que moltes biomolècules es dissolen millor en aigua i en solvents polars.
Cromatografia d'intercanvi iònic
En aquest tipus de cromatografia l'analit, amb càrrega positiva o negativa, es desplaça a través de la columna substituint els ions que alberga. Mentre més gran sigui la càrrega, major serà la seva retenció, de manera que és àmpliament utilitzada per separar complexos iònics de metalls de transició.
Cromatografia d'exclusió molecular
Aquesta cromatografia, més que separar, s'encarrega de purificar la mescla resultant. Com el seu nom indica, l'analit es separa ja no en funció de què tan afí sigui a la fase estacionària, sinó d'acord a la seva grandària i masses moleculars.
Les molècules més petites seran més retingudes que les molècules grans, ja que aquestes últimes no queden atrapades entre els porus dels farcits polimèrics de les columnes.
aplicacions
La HPLC permet realitzar tant anàlisis qualitatives com quantitatives. Pel que fa al qualitatiu, a l'comparar els temps de retenció de l'cromatograma sota determinades condicions, es pot detectar la presència d'un compost en particular. Aquesta presència pot ser indicativa d'una malaltia, adulteració, o consum de drogues.
Per tant, és un equip forma part dels laboratoris de diagnòstic. Així mateix, es troba dins de les indústries farmacèutiques, ja que permet comprovar la puresa del producte, així com la qualitat de la mateixa pel que fa a la seva dissolució en el medi gàstric. Els materials de partida també se sotmeten a l'HPLC per purificar-los i garantir un millor rendiment en la síntesi de fàrmacs.
La HPLC permet analitzar i separar mescles complexes de proteïnes, aminoàcids, carbohidrats, lípids, porfirines, terpenoides, i en essència és l'elecció ideal per treballar amb extractes vegetals.
I per finalitzar, la cromatografia per exclusió molecular permet seleccionar polímers de diferents mides, ja que alguns poden ser més petits o grans que altres. D'aquesta manera s'obtenen productes amb baixes o altes masses moleculars mitjana, sent això un factor determinant en les seves propietats i futures aplicacions o síntesi.
referències
- Day, R., & Underwood, A. (1989). Química Analítica Quantitativa. (Cinquena ed.). PEARSON Prentice Hall.
- Bussi Joan. (2007). Cromatografia de líquids d'alta eficàcia.. Recuperat de: fing.edu.uy
- Wikipedia. (2019). High-performance liquid chromatography. Recuperat de: en.wikipedia.org
- Clark Jim. (2007). High Performance Liquid Chromatography. Recuperat de: chemguide.co.uk
- Matthew Barkovich. (5 desembre 2019). High Performance Liquid Chromatography. Chemistry LibreTexts. Recuperat de: chem.libretexts.org
- GP Thomas. (15 d'abril de 2013). High Performance Liquid Chromatography (HPLC) - Methods, Benefits and Applications. Recuperat de: azom.com