CITOQUÍMICA: HISTÒRIA, OBJECTE D'ESTUDI, UTILITAT I TÈCNIQUES - BIOLOGIA - 2025

La citoquímica comprèn una sèrie de tècniques que es fonamenten en la identificació i disposició de certes substàncies específiques a l'interior de la cèl·lula. Es considera una branca de la biologia cel·lular que combina la morfologia de la cèl·lula amb l'estructura química.

Segons Bensley, fundador de l'aplicació de la citologia moderna, expressa que la finalitat de la citoquímica és descobrir l'organització química de les cèl·lules per a poder comprendre els misteris de la vida. Així com també estudiar els canvis dinàmics que tenen lloc durant els diferents estadis funcionals.

1: Malaltia extramamaria de Paget. (Hematoxilina-Eosina) 2: plaques senils observades en l'escorça cerebral en un pacient amb malaltia d'Alzheimer. (Impregnació de plata) 3: Llengua de conill, Fibres de col·lagen (blau). Fibres musculars (tires morades). (Tricrómica de Masson). 4: Teixit hepàtic amb degeneració greix. (Sudan III) 5: Fetge inflamat. Necrosi. (Blau de toluidina) Fonts: Wikipedia. com / User: KGH / Public Domain files / Mohit Lalwani

D'aquesta manera és possible determinar el paper metabòlic que compleixen aquestes substàncies dins de la cèl·lula.

La citoquímica utilitza dos mètodes principals. El primer es basa en procediments químics i físics. Aquestes tècniques recorren a l'ús de l'microscopi com a instrument indispensable per a visualitzar les reaccions químiques ocorregudes sobre substàncies específiques dins de la cèl·lula.

Exemple: l'ús de colorants citoquímics, com ara la reacció de Feulgen o reacció de PAS, entre d'altres.

El segon mètode es fonamenta en la bioquímica i en la microquímica. Amb aquesta metodologia és possible determinar quantitativament la presència de substàncies químiques intracel·lulars.

Entre les substàncies que es poden posar en evidència en un teixit o estructura cel·lular estan els següents: proteïnes, àcids nucleics, polisacàrids i lípids.

Història de la citoquímica

Les tècniques citoquímiques des de la seva invenció han ajudat a comprendre la composició de les cèl·lules, ia través de el temps han sorgit una varietat de tècniques que utilitzen diversos tipus de colorants amb afinitats i fonaments dissemblants.

Posteriorment, la citoquímica va obrir nous horitzons amb l'ús de determinats substrats per evidenciar colorimètricament la presència d'enzims o altres molècules dins de la cèl·lula.

Així mateix, han sorgit altres tècniques com la immunocitoquímica que ha estat de gran ajuda per al diagnòstic de moltes malalties. La immunocitoquímica es basa en reaccions antigen-anticòs.

D'altra banda, la citoquímica també ha utilitzat substàncies fluorescents denominades fluorocroms, que són excel·lents marcadors per a la detecció de certes estructures cel·lulars. A causa de les característiques de l'fluorocrom, destaca les estructures a la qual s'ha fixat.

Què s'estudia?

Les diverses tècniques citoquímiques utilitzades sobre una mostra biològica tenen alguna cosa en comú: posar en evidència la presència d'un tipus específic de substància i conèixer la seva localització dins de l'estructura biològica en avaluació, bé sigui un tipus cel·lular o un teixit.

Aquestes substàncies poden ser enzims, metalls pesants, lípids, glicogen i grups químics definits (aldehids, tirosina, etc.).

La informació aportada per aquestes tècniques pot orientar no només per a la identificació de cèl·lules, sinó també per al diagnòstic de diverses patologies.

Per exemple, les tincions citoquímiques són molt útils per diferenciar entre els diversos tipus de leucèmies, ja que algunes cèl·lules expressen certs enzims o substàncies claus i altres no.

D'altra banda, cal destacar que perquè sigui possible l'ús de la citoquímica s'han de prendre les següents consideracions:

1) La substància ha de ser immobilitzada en el lloc on aquesta es troba naturalment.

2) La substància ha d'identificar-usant substrats que reaccionen de forma específica amb ella i no amb altres compostos.

utilitat

Les mostres que poden ser estudiades a través de les tècniques citoquímiques són:

- Estesos de sang perifèrica.

- Estesos de medul·la òssia.

- Teixits fixats per a tècniques d'histoquímica.

- Cèl·lules fixades per citocentrifugación.

Les tècniques citoquímiques són de gran suport en l'àrea de hematologia, ja que són molt utilitzades per ajudar en el diagnòstic i diferenciació de certs tipus de leucèmies.

Per exemple: Les reaccions de esterases serveixen per diferenciar entre una leucèmia mielomonocítica d'una leucèmia monocítica aguda.

Els frotis de medul·la òssia i sang perifèrica d'aquests pacients s'assemblen, ja que algunes cèl·lules són difícils d'identificar només des del punt de vista morfològic. Per a això es realitza la prova d'esterasa.

A la primera donen positives les esterases específiques, mentre que en la segona donen positiva les esterases inespecífiques.

També són de gran utilitat en histologia, ja que per exemple l'ús de la tècnica de coloració amb metalls pesat (impregnació argèntica), tenyeix les fibres reticulars de color marró intens en el teixit miocàrdic.

Tècniques en citoquímica

A continuació s'explicaran les tècniques més usades:

- Ús de colorants

Els colorants utilitzats són molt diversos en les tècniques citoquímiques i aquests poden classificar-se segons diversos punts de vista:

D'acord a l'radical pel que tenen afinitat

Es divideixen en: àcids, bàsics o neutres. Són els més senzills i els més utilitzats a través de la història, permetent distingir els components basòfils dels acidòfils. Exemple: la coloració hematoxilina-eosina.

En aquest cas, els nuclis de les cèl·lules es tenyeixen de blau (prenen l'hematoxilina que és el colorant bàsic) i els citoplasmes de vermell (prenen la eosina que és el colorant àcid).

Segons el color que proporcionen

Poden ser ortocromático o metacromáticos. Els ortocromáticos són aquells que tenyeixen les estructures de el mateix color que posseeix el colorant. Per exemple, el cas de l'eosina, el color és vermell i tenyeix de vermell.

Els metacromáticos en canvi tenyeixen les estructures d'un color diferent al d'ells, com ara la toluidina, la color és el blau i, no obstant això, tenyeix de violeta.

Colorants vitals o supravitales

Són colorants innocus, és a dir, que acoloreixen a les cèl·lules i aquestes es mantenen vives. A aquests colorants se'ls crida vitals (ex: el blau de tripán per tenyir macròfags) o supravitales (ex: el verd de Janus per tenyir mitocòndries o el vermell neutre que tenyeix els lisosomes).

- Detecció de lípids per mitjà de colorants liposolubles

Tetròxid d'osmi

Tenyeix als lípids (àcids grassos no saturats) de color negre. Aquesta reacció pot observar-se amb el microscopi òptic, però pel fet que aquest colorant és d'alta densitat també pot ser visualitzat amb microscopi electrònic.

Sudan III

És un dels més utilitzats. Aquest colorant es difon i solubilitza en els teixits, acumulant-se en l'interior de les gotes de lípid. El color és vermell escarlata.

Tinció del Sudan negre B

Produeix millor contrast que els anteriors pel fet que és capaç de dissoldre també en els fosfolípids i en el colesterol. És útil per detectar grànuls azurófilos i específics dels granulòcits madurs i dels seus precursors. Per tant identifica les leucèmies mieloides.

- Tinció de grups aldehids (tinció de l'àcid periòdic de Schiff)

La tinció de àcid periòdic de Schiff pot detectar tres tipus de grups aldehids. Ells són:

- Els aldehids lliures, presents naturalment en els teixits (reacció plasmal).

- Aldehids produïts per oxidació selectiva (reacció de PAS).

- Aldehids generats per hidròlisi selectiva (reacció de Feulgen).

Reacció de el PAS

Aquesta tinció es basa en detectar certs tipus de carbohidrats, com ara el glucogen. El àcid periòdic de Schiff trenca els enllaços CC dels carbohidrats causa de l'oxidació dels grups glicòlics 1-2, aconseguint alliberar grups aldehids.

Els grups d'aldehids lliures reaccionen amb el reactiu de Schiff i formen un compost de color vermell porpra. L'aparició de la color vermell porpra evidència una reacció positiva.

Aquesta prova dóna positiva en cèl·lules vegetals, detectant midó, cel·lulosa, hemicel·lulosa i peptinas. Mentre que en cèl·lules animals detecta mucines, mucoproteínas, àcid hialurònic i quitina.

A més, és útil en el diagnòstic de leucèmies limfoblàstiques o eritroleucemia, entre d'altres patologies de l'tipus mielodisplásicas.

En el cas d'hidrats de carboni àcids es pot utilitzar la tinció de blau Alcián. La prova és positiva si s'observa un color blau cel / turquesa.

reacció plasmal

La reacció plasmal posa en evidència la presència de certs aldehids alifàtics de cadena llarga com el Palmital i el estearal. Aquesta tècnica s'aplica sobre talls histològics congelats. Es tracta de forma directa amb el reactiu de Schiff.

Reacció de Feulgen

Aquesta tècnica detecta la presència d'ADN. La tècnica consisteix a sotmetre a el teixit fixat a una hidròlisi àcida dèbil per posteriorment fer-lo reaccionar amb el reactiu de Schiff.

La hidròlisi deixa exposat els grups aldehids de la desoxirribosa a nivell de la unió desoxiribosa-purina. Després, el reactiu de Schiff reacciona amb els grups aldehids que van quedar lliures.

Aquesta reacció dóna positiva en els nuclis i negativa en els citoplasmes de les cèl·lules. La positivitat s'evidencia per la presència d'un color vermell.

Si aquesta tècnica es combina amb el verd de metil-pironina és possible detectar de forma simultània l'ADN i l'ARN.

- Tincions citoquímiques per a estructures proteiques

Per a això es pot utilitzar la reacció de Millon, la qual s'utilitza com a reactiu el nitrat de mercuri. Les estructures que continguin aminoàcids aromàtics es tenyiran de color vermell.

- Tincions citoquímiques que utilitzen substrats per evidenciar la presència d'enzims

Aquestes tincions es basen en la incubació de la mostra biològica amb un substrat determinat i el producte de la reacció reacciona posteriorment amb sals diazoicas per formar un complex acolorit.

esterases

Aquests enzims són presents en els lisosomes d'algunes cèl·lules hemàtiques i són capaços d'hidrolitzar els èsters orgànics alliberant naftol. Aquest últim forma un azocolorante insoluble quan s'uneix a una sal diazoica, tenyint el lloc on ocorre la reacció.

Hi ha diversos substrats i depenent qual s'usi es poden identificar esterases específiques i esterases inespecífiques. Les primeres són presents en les cèl·lules immadures de la sèrie mieloide i les segones en les cèl·lules d'origen monocíticas.

El substrat utilitzat per a la determinació de esterases específiques és: el naftol-AS-D cloroacetato. Mentre que per a la determinació de esterases inespecífiques es poden usar diversos substrats com el naftol AS-D acetat, l'alfa naftil acetat i l'alfa naftil butirat.

En tots dos casos les cèl·lules es tenyiran de color vermell intens quan la reacció sigui positiva.

mieloperoxidasa

Aquest enzim es troba en els grànuls azurófilos de les cèl·lules granulocíticas i dels monòcits.

La seva detecció s'utilitza per diferenciar les leucèmies d'origen mieloide respecte de les limfoides. Les cèl·lules que contenen mieloperoxidasas s'acoloreixen de groc ocre.

fosfatases

Aquests enzims alliberen àcids fosfòrics de diferents substrats. Es diferencien entre si d'acord a l'especificitat de l'substrat, el pH i l'acció d'inhibidors i inactivadores.

Entre les més conegudes hi ha les fosfomonoesterasas que hidrolitzen èsters simples (PO). Exemple: la fosfatasa alcalina i la fosfatasa àcida, així com les fosfamidasas que hidrolitzen les unions (PN). Aquestes són usades per diferenciar síndromes limfoproliferatives i per al diagnòstic de tricoleucèmia.

- Coloracions tricrómicas

Tricròmic de Mallary-Azan

Són útils per diferenciar el citoplasma de les cèl·lules de les fibres de el teixit connectiu. Les cèl·lules es tenyeixen de vermell i les fibres col·làgenes de blau.

Tricròmic de Masson

Aquesta té la mateixa utilitat que l'anterior però, en aquest cas, les cèl·lules es tenyeixen de vermell i les fibres col·làgenes de verd.

- Colorants que tenyeixen orgànuls específics

Verd de Janus

Aquest tenyeix selectivament a les mitocòndries.

Sales de plata i àcid òsmic

Tenyeix a l'aparell de Golgi.

Blau de toluidina

Tenyeix els cossos de Nissi

Sales de plata i PAS

Tenyeixen les fibres reticulars i la làmina basal.

Orceïna i fucsina resorcina

Tenyeixen les fibres elàstiques. Amb la primera es tenyeixen de color cafè i amb la segona de color blau o morat intens.

- Altres tècniques utilitzades en citoquímica

Ús de substàncies fluorescents o fluorocroms

Hi tècniques que utilitzen substàncies fluorescents per estudiar la localització d'una estructura en una cèl·lula. Aquestes reaccions són visualitzades amb microscopi especials anomenats de fluorescència. Exemple: tècnica de IFI (Immunofluorescència indirecta).

Detecció de components cel·lulars mitjançant immunocitoquímica

Aquestes tècniques són de gran utilitat en medicina ja que ajuden a detectar certa estructura cel·lular i també la quantifica. Aquesta reacció es basa en una reacció antigen-anticòs. Per exemple: les tècniques d'ELISA (Enzim Immuno Assaig).

recomanacions

- Cal utilitzar frotis controls per avaluar el bon funcionament dels colorants.

- S'ha d'usar frotis frescos per ser sotmesos a coloracions citoquímiques. Si no és possible s'han de mantenir protegits de la llum i conservats a 4 ° C.

- S'ha de cuidar que el fixador utilitzat no influeixi negativament sobre la substància a investigar. És a dir, s'ha d'evitar que aquest sigui capaç d'extreure-o inhibir-la.

- S'ha de respectar el temps d'ús dels fixadors, doncs en general només ha de durar segons, ja que exposar el frotis més temps a el fixador pot danyar alguns enzims.

referències

1. «Citoquímica.» Viquipèdia L'enciclopèdia lliure. 30 jun 2018, 17:34 UTC. 9 jul 2019, 02:53 Disponible a: wikipedia.org
2. Villarroel P, de Suárez C. Mètodes d'Impregnació Metàl·lica per a l'Estudi de les Fibres Bidireccionals miocàrdiques: Estudi comparatiu. RFM 2002; 25 (2): 224-230. Disponible a: scielo.org
3. Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T. Citoquímica de la fosfatasa àcida: Consideracions metodològiques. Rev Diagn Biol. 200; 50 (2): 89-92. Disponible a: scielo.org
4. De Robertis I, De Robertis M. (1986). Biologia cel·lular i molecular. 11 va edició. Editorial Ateneu. Buenos Aires, Argentina.
5. Eines clàssiques per a l'estudi en biologia cel·lular. TP 1 (material complementari) - Biologia Cel·lular. Disponible a: dbbe.fcen.uba.ar