BUFFER DE FOSFATS (PBS): FONAMENT, PREPARACIÓ I USOS - BIOLOGIA - 2025

El buffer de fosfats, BPS o buffer fosfat salí és una solució amortidora i isotònica, la funció és mantenir el pH i la pressió osmòtica el més semblant a l'ambient biològic natural (fisiològic). Les sigles PBS signifiquen phosphate buffered saline.

El pH i l'osmolaritat són dos aspectes molt importants que han de ser controlats en certs protocols de laboratori. En el cas de l'pH és imprescindible que sigui controlat, especialment en reaccions bioquímiques, ja que aquestes poden variar o no executar si els reactants estan en un pH inadequat.

Buffer fosfat salí PBS en dos pH diferents. Font: Pixinio.com

Com a, el control de l'osmolaritat és essencial sobretot quan es treballa amb cèl·lules vives, ja que les membranes plasmàtiques de les cèl·lules reaccionen d'acord a la concentració de soluts en la qual es trobin.

Si les cèl·lules són traslladades a un mitjà hipertònic es deshidratarán, ja que el gradient d'aigua es transportarà a la banda on hi ha major concentració de soluts. Si per contra es col·loquen cèl·lules en un medi hipotònic, les cèl·lules absorbeixen líquid fins lisarse.

És per això que s'utilitza el buffer PBS per protocols de laboratori que requereixen el manteniment de cèl·lules in vitro, d'aquesta manera les cèl·lules no es faran malbé.

El PBS està compost per una combinació de sals, com ara clorur de sodi, fosfat de sodi, clorur de potassi i fosfat de potassi. La composició de l'PBS pot variar depenent el protocol.

fonament

Bàsicament la funció de la memòria intermèdia fosfat salí és mantenir un pH fisiològic constant al costat d'una concentració electrolítica similar a la que es troba a l'interior de l'organisme.

En aquest ambient les cèl·lules són capaces de mantenir-se estables, ja que es simula en el possible les condicions fisiològiques.

A la formulació original de l'PBS poden agregar altres compostos de ser necessaris, per exemple l'addició d'EDTA a la memòria intermèdia és útil per al rentat de glòbuls vermells a la prova d'incompatibilitat creuada.

L'EDTA impedeix que la fracció de l'complement C1 present en el sèrum, s'escindeixi i lise als glòbuls vermells, és a dir, evita resultats falsos d'incompatibilitat. A més l'EDTA ajuda a dissociar a les cèl·lules.

preparació

La quantitat de sals que s'han de tot per a l'elaboració de la memòria intermèdia fosfat salí PBS dependrà de la quantitat que es requereixi preparar:

-Solució mare buffer fosfat salí (PBS 10X)

Per a un litre de solució:

pesar:

80,6 g de NaCl,

2,2 g de KCl, 11,5 g de Na ₂ HPO ₄, 2,0 g de KH ₂ HPO ₄

Tècnica de preparació

En un got de precipitat col·loqui les sals pesades, afegiu suficient aigua (80%) i barregi sobre la planxa agitadora amb barra magnètica fins que es dissolguin les sals.

Preparació de l'PBS utilitzant planxa agitadora amb barra magnètica. Font: User: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Filtri per eliminar les partícules no dissoltes. Utilitzeu filtres amb porus de 0,45 micres. Esterilitzi en autoclau i distribueixi asèpticament en campana de flux laminar en flascons de vidre amb tapa.

A la solució 10X (concentrada) no s'ajusta el pH. L'ajust es realitza un cop diluïda a la concentració buffer PBS 1X, (dilució 1:10).

-Buffer fosfat salí (PBS 1X)

El PBS 1X pot preparar-se de manera directa, pesant les quantitats corresponents de cada sal o pot preparar diluint la solució mare (1:10) amb aigua destil·lada estèril.

-Per preparar directament un litre de memòria intermèdia fosfat salí PBS 1X tot:

8,06 g de NaCl, 0,22 g de KCl, 1,15 g de Na ₂ HPO ₄, 0,20 g de KH ₂ HPO ₄

Tècnica de preparació

Procedir com es va explicar en la solució concentrada. Posteriorment s'ha d'ajustar el pH. Per a això mesuri el pH i depenent de el resultat utilitzi àcid (HCl) o base (NaOH) per baixar o pujar el pH respectivament segons sigui necessari, fins que quedi en 7,4.

L'àcid o la base s'agreguen gota a gota mentre es va monitoritzant el valor de l'pH de la solució utilitzant un pH-metre. Filtri, esterilitzi en autoclau i distribueixi asèpticament en tubs cònics o flascons segons sigui necessari.

-Per preparar el PBS 1X a partir de la solució mare 10X:

Feu una dilució 1:10. Per exemple, per preparar 1 litre de PBS 1X, mesuri 100 ml de la solució mare i afegiu 700 ml d'aigua destil·lada estèril. Ajusteu el pH i completi la quantitat d'aigua fins arribar a 1000 ml.

El buffer PBS preparat és incolor i transparent.

L'PBS d'ús diari es pot guardar a temperatura ambient i la resta en nevera.

.Soluciones per a l'ajust de pH

HCl

Per 100 ml d'HCL (àcid clorhídric) a l'1 molar.

Mesurar 91 ml d'aigua destil·lada i col·locar-lo en un got precipitat de 250 ml de capacitat.

Mesurar 8,62 ml d'HCl concentrat i afegir lentament al vas de precipitats que conté l'aigua (mai ho faci a l'inrevés). Prendre les mesures de bioseguretat pertinents a l'manipular àcids forts (substància altament corrosiva).

Barrejar per 5 minuts utilitzant preferiblement una planxa agitadora amb una barra magnètica a l'interior de l'vas. Passar a una pilota de 100 ml i enrasar a 100 ml amb H ₂ O destil·lada.

NaOH

Per 100 ml de NaOH (hidròxid de sodi) 10 molar.

Mesurar 40 ml d'aigua destil·lada i es diposita en un got de precipitats de 250 ml de capacitat. Mesurar 40 gr de NaOH i afegir a l'aigua. Barrejar fent ús d'una planxa agitadora amb una barra magnètica a l'interior de l'vas.

Passar a una pilota aforat de 100 ml i enrasar amb aigua destil·lada. Complir amb les normes de bioseguretat, pel fet que aquesta reacció és exotèrmica (allibera energia en forma de calor).

Si es desitja preparar altres quantitats de solució fosfat salí es pot consultar la següent taula:

Font: «Laboratori de Genòmica Viral i Humana, Facultat de Medicina UASLP»

usos

Principalment s'usa en laboratoris de biologia cel·lular, immunologia, immunohistoquímica, bacteriologia, virologia i investigació.

És ideal per fer rentats cel·lulars per centrifugats (glòbuls vermells), rentats de monocapes cel·lulars, en tècniques de elipsometría espectroscòpica, en la quantificació de biopel·lícules bacterianes, en el manteniment de cultius cel·lulars per virus, com a solució de rentat en la tècnica d'immunofluorescència indirecta i en tècniques per a la caracterització d'anticossos monoclonals.

També serveix per transportar cèl·lules o teixits, com diluent per al comptatge de cèl·lules, la preparació d'enzims cel·lulars (tripsina), com diluent de el mètode de dessecació de biomolècules i per preparar altres reactius.

D'altra banda, Martin i col·laboradors en 2006 van demostrar que el PBS és útil en laboratoris de ciències forenses, específicament en la recuperació d'espermatozoides provinents de frotis vaginals, o en la recuperació de cèl·lules vaginals de frotis de penis. D'aquesta manera es pot establir si hi ha hagut una relació sexual.

limitacions

-Alguns buffer PBS porten com preservant una substància anomenada azida de sodi. Aquest compost pot generar substàncies explosives si es posa en contacte amb plom o coure. Per aquest motiu s'ha de tenir especial cura a l'descartar aquest reactiu pel desguàs. Si es descarta per aquesta via s'ha d'afegir abundant aigua per diluir a l'màxim.

-Al buffer fosfat no se li ha addicionar Zinc, ja que fa precipitar algunes sals.

-Wangen i col·laboradors en el 2018 van determinar que l'ús de PBS no era adequat per al rentat de cèl·lules primàries de leucèmia mieloide aguda (AML) extretes de sang perifèrica, pel fet que es perden moltes cèl·lules per lisi, amb una gran disminució de l'material proteic.

Per tant, van determinar que les cèl·lules primàries de AML no s'han de rentar amb PBS després de l'emmagatzematge en nitrogen líquid.

referències

1. Coll J. (1993). Tècniques de diagnòstic en virologia. Ed Díaz de Santos. 360 pg
2. Rodríguez M, Ortiz T. Cultiu cel·lular. Canvi de Medi. Departament de Citologia i Histologia Normal i Patològica Universitat de Sevilla. Disponible en personal.us.es
3. Preparació de Phosphate buffered Saline (PBS). (2008). Standard Operating Procedures (SOPs) Laboratori de Genòmica Viral i Humana Facultat de Medicina UASLP. Disponible a: genomica.uaslp.mx
4. «Tampó fosfat salí.» Viquipèdia L'enciclopèdia lliure. 3 abr 2019, 19:36 UTC. 13 abr 2019, 02:57 es.wikipedia.org.
5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C.Tópicos en biofísica molecular. Disponible a: users.df.uba.ar
6. Rediar. Manual d'Instruccions. PBS + EDTA. Disponible a: felsan.com.ar
7. Martin NC, Pirie AA, Ford LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG. The use of phosphate buffered saline for the recovery of cells and spermatozoa from swabs. Sci Justice. 2006; 46 (3): 179-84. Disponible in: ncbi.nlm.nih.gov
8. Wangen R, Aasebø I, Trentani A, et al. Preservation Method and Phosphate buffered Saline Washing Affect the Acute Myeloid Leukemia Proteome. Int J Mol Sci. 2018; 19 (1): 296. Disponible in: ncbi.nlm.nih.gov
9. Martínez R, Gragera R. (2008). Fonaments teòrics i pràctics de la histoquímica. Consell Superior d'Investigacions Científiques. Madrid. Disponible a: books.google.co.ve