- fonament
- reactius
- Estabilitat de l'reactiu de Biuret
- procediment
- tècnica
- Corba de calibratge
- interferències
- Substàncies que interfereixen en la prova de Biuret
- Substàncies que no interfereixen en la prova de Biuret
- avantatges
- desavantatges
- usos
- Patologies que cursen amb augment o disminució de
- mostres clíniques
- Valor normal d'índex proteïna en orina / creatinina en orina
- Mostres no clíniques
- referències
El Biuret és un reactiu que s'empra per a la determinació de proteïnes de cadena llarga i de cadena curta. És especialment utilitzat en l'àrea de química analítica i uroanálisis per investigar la concentració de proteïnes totals en sèrum, plasma i orina.
Els valors de proteïnes poden augmentar o disminuir en certes patologies. Solen presentar-se quadres de hipoproteinemias en pacients amb malaltia renal, en desnodrits i en pacients amb infeccions cròniques.
Estructura química de l'complex format en la reacció de Biuret Prova de Biuret positiva. Font: Yikrazuul / Flickr
Mentre que s'observa hiperproteinemia en patologies com el mieloma múltiple, lupus eritematós sistèmic, endocarditis bacteriana, meningitis bacteriana, macroglobulinemia de Waldenstrom, entre d'altres.
D'altra banda, la presència de proteïnes en l'orina es deu a la filtració d'albúmina pel ronyó. Això és un comportament patològic que s'ha d'estudiar.
En aquest sentit, el Biuret és de gran utilitat, ja que permet quantificar la presència de proteïnes en sèrum, plasma, orina, entre moltes altres mostres.
Fins i tot el Biuret es pot emprar per investigar la presència i la concentració de proteïnes en mostres poc explorades o de composició desconegudes. Per tant, és molt utilitzat en l'àrea d'investigació.
La prova de Biuret es fonamenta en detectar els enllaços peptídics. La prova es dóna en medi alcalí. La mostra ha de contenir al menys dos enllaços peptídics perquè es pugui formar un complex de color violeta-porpra. El complex es forma per la unió dels enllaços i l'ió de coure.
fonament
El reactiu de Biuret està compost per hidròxid de potassi, sulfat cúpric i tartrat de sodi i de potassi. L'hidròxid de sodi s'utilitza per alcalinitzar el medi, ja que aquesta condició és indispensable perquè es doni la reacció.
Les substàncies que reaccionen amb les proteïnes és el sulfat cúpric, mentre que el tartrat de sodi té com a funció no permetre la formació d'hidròxid de coure, el qual tendeix a precipitar i interfereix en la reacció.
Si en la mostra es troben substàncies que continguin enllaços peptídics (polipèptids o proteïnes) la prova donarà positiva.
Una reacció s'interpreta com a positiva quan la solució es torna de color violeta. El color es produeix per la formació d'un complex entre al menys dos enllaços peptídics que posseeixen el grup CO-NH i els cations cúprics.
El complex violeta es pot formar de dues maneres: una és per la pèrdua de protons dels grups amides que s'uneixen a l'metall (despronotación), i l'altra per la unió dels electrons d'oxigen i nitrogen que es trobin lliures i s'uneixen amb el coure.
Aquesta reacció pot variar en intensitat i en el color depenent de el tipus de proteïna.
La prova es pot realitzar de forma qualitativa o quantitativa. En la forma qualitativa es reporta com a positiu o negatiu. Mentre que en la forma quantitativa es pot mesurar la concentració pel mètode espectrofotomètric.
La reacció es llegeix entre 540-560 nm. La intensitat del color és directament proporcional a la concentració d'enllaços peptídics de la mostra.
reactius
-Hidróxido de sodi (NaOH) a l'20%
-Sulfato cúpric pentahidratado a l'1% (CuSO 4. 5H 2 O)
-Tartrato mixt de sodi i potassi tetrahidratat (KNAC 4 H 4 O 6 · 4H 2 O)
Estabilitat de l'reactiu de Biuret
-Ha de conservar-se en refrigeració.
procediment
tècnica
-Col·locar 100 ml de la mostra o de el patró a analitzar en un tub d'assaig.
-Adicionar 2 ml d'hidròxid de sodi.
-Barrejar molt bé.
-Adicionar 5 ml de reactiu de Biuret.
-Barrejar i deixar en repòs 25 minuts a temperatura ambient, tapar i protegir de la llum.
-Observar la formació o no de color i mesurar espectofotométricamente.
Corba de calibratge
Per realitzar la corba de calibratge es pot utilitzar albúmina sèrica bovina com a patró. D'ella es preparen diverses concentracions. Per exemple 25, 50, 75, 100, 125 i 150%.
Es munta la reacció amb totes aquestes concentracions conegudes i es llegeix l'absorbància a una longitud d'ona de 540 nm. Amb les dades de les concentracions conegudes i les lectures de absorbàncies es realitza la corba de calibratge.
A cada determinació o lot de mostres processades és recomanable muntar un patró. Com a patró de calibratge es pot utilitzar albúmina sèrica bovina a l'0,1-2 mg / ml.
Els mesuraments es realitzen en un espectofotómetro a 540 nm.
Es compleix la linealitat fins a una concentració de 12 g / dl.
interferències
Substàncies que interfereixen en la prova de Biuret
Encara que no és molt freqüent, cal destacar que durant l'execució d'aquesta prova poden interferir algunes substàncies. Per exemple, la presència d'amoni pot inhibir la formació de la color.
Així mateix, altres substàncies podrien absorbir a la mateixa longitud d'ona, com per exemple certs pigments.
D'altra banda, es pot generar una interferència quan una altra substància diferent a l'enllaç peptídic forma un complex amb la sal cúprica. Exemple: alguns carbohidrats i certs lípids.
En cas que la mostra a analitzar present algun tipus de precipitat, aquesta ha de filtrar o centrifugar abans de muntar la prova.
Substàncies que no interfereixen en la prova de Biuret
La prova no es veu afectada per la presència de:
-Bilirrubina fins a una concentració de 20 mg / dl.
-Hemoglobina fins a una concentració de 750 mg / dl.
-Dextrano fins a una concentració de 30 g / L.
-Triglicéridos fins a una concentració de 4000 mg / dl.
avantatges
-És un mètode senzill d'executar.
-És una prova econòmica.
-Té alta especificitat per proteïnes.
Poques interferències.
desavantatges
Té poca sensibilitat per detectar baixes quantitats de proteïnes. El treball realitzat per Fuentes i col·laboradors afirma que el mètode de la prova de Biuret posseeix un límit de detecció de 1 mg / ml de proteïna i un límit de quantificació de 3 mg / ml.
No obstant això, una altra investigació realitzada a la Universitat de Amazònia reporten valors molt més baixos. El límit de detecció que l'estudi reporta és de 0,020 mg / ml i el límit de quantificació de 1.33 mg / ml.
usos
El reactiu o prova de Biuret s'utilitza per a la determinació de proteïnes en mostres clíniques i no clíniques en els laboratoris de rutina i d'investigació.
Patologies que cursen amb augment o disminució de
En moltes patologies és important determinar la concentració de proteïnes totals en mostres clíniques, podent estar elevades o disminuïdes.
Es troben elevades en:
-Mieloma múltiple, -Lupus eritematós sistèmic, -Endocarditis bacteriana, -Meningitis bacteriana, Macroglobulinèmia de Waldenstrom, entre d'altres.
Es troba disminuïdes en:
-Insuficiència renal, -Persones amb graus de desnutrició severs, -Pacients amb infeccions cròniques, entre d'altres.
mostres clíniques
Les mostres clíniques més comuns són sèrum, plasma i orina. El valor normal de les proteïnes en sèrum o plasma és de 6.0-8.8 g / dl.
La concentració de proteïnes en l'orina en adults no sobrepassar la xifra de 150 mg / 24 hores.
Valor normal d'índex proteïna en orina / creatinina en orina
Lactants: <a 0,50 mg
Nens de 2 anys en endavant: índex: 0,20 mg
Adults: <0,2 mg
Mostres no clíniques
La reacció de Biuret pot usar-se per a molts tipus de mostres no clíniques, com per exemple en productes lactis, sèrums antiofídicos o qualsevol substància desconeguda a la qual se li vulgui investigar la presència de proteïnes.
referències
- Vázquez J, Guerra L, Quintana J, Ramírez J, Fernando Ry Vázquez Y. (2014). Caracterització fisicoquímica i contingut de proteïnes d'extractes fluids de l'ostión de mangle (Crassostrearizophorae). Revista Cubana de Química, 26 (1), 66-74. Recuperat en 26 de juny de 2019, de http: //scielo.sld
- Chaparro S, Lara A, Sandoval A, Sosa S, Martínez J, Gil J. Caracterització funcional de l'ametlla de les llavors de mango (Mangifera indica L.) Revista Ciència en Desenvolupament. 2015; 6 (1): 67-75
- «Biuret.» Viquipèdia L'enciclopèdia lliure. 19 jun 2019, 16:37 UTC. 26 jun 2019, 22:18
- Fonts F, Quispe I, García J. Estandardització de el mètode de Biuret per quantificar proteïnes totals en sèrum antibotrópico polivalent produït en el centre nacional de productes biològics de l'INS. Bol - Inst Nac Salut 2012; 18 (11-12). Disponible a: repositorio.ins.gob.pe
- Laboratoris Winer. Proteïnes totals. Mètode colorimètric per a la determinació de proteïnes totals en sèrum i plasma. Disponible a: wiener-lab.com.ar