- fonament
- Clorur de sodi i agar
- Indicador de pH (vermell de fenol)
- Derivats proteics (extracte de llevat, extracte de carn, peptona i proteosa peptona)
- Fermentació de carbohidrats (glucosa, lactosa i sacarosa)
- -Microorganismos no fermentadors de glucosa
- -Microorganismos no fermentadors de lactosa / sacarosa
- -Microorganismos fermentadors de lactosa / sacarosa
- Producció de gas
- Tiosulfat de sodi i sulfat ferrós d'amoni
- preparació
- usos
- sembrat
- limitacions
- referències
El agar TSI o agar ferro triple sucre és un mitjà de cultiu sòlid que serveix com a prova bioquímica per orientar la identificació inicial dels bacils Gram negatius. Es fonamenta en evidenciar la fermentació dels sucres presents, i la producció de sulfur d'hidrogen i gas.
La seva composició i fonament és molt similar a la prova de Kligler ferro, amb la diferència que aquest últim conté només glucosa i lactosa. En canvi, -com el seu nom ho indica- l'agar ferro triple sucre conté tres carbohidrats fermentables: glucosa, lactosa i sacarosa.
Imatges de la prova TSI amb diferents microorganismes A. Escherichia coli, B. Shigella flexneri, C) Salmonella typhimurium, D. Pseudomonas aeruginosa. Font: Witmadrid, from Wikimedia Commons
A més, el medi TSI posseeix quatre derivats proteics que el fan ser un agar molt nutritiu: extracte de llevat, extracte de carn, peptona i proteosa peptona. També conté sulfat ferrós d'amoni, tiosulfat de sodi, clorur de sodi, vermell de fenol i agar.
La incapacitat d'un microorganisme en fermentar la glucosa present en el medi l'exclou immediatament de pertànyer a la Família Enterobacteriaceae. D'això que aquesta prova és essencial per decidir quina ruta d'identificació s'ha de prendre per determinar el gènere i l'espècie.
Cada laboratori decideix si treballa amb agar TSI o amb agar Kligler ferro.
fonament
Cadascun dels compostos compleix una funció dins de l'mig.
Clorur de sodi i agar
El clorur de sodi és necessari per mantenir l'equilibri osmòtic de l'mig. Com a l'agar li dóna la consistència sòlida.
Indicador de pH (vermell de fenol)
El pH de l'mig preparat està equilibrat a 7,3 i l'indicador de pH (vermell de fenol) vira a groc per sota de 6,8. Això vol dir que petites quantitats d'àcids produïts per la fermentació dels sucres faran virar el mitjà de color vermell-taronja a groc.
Si no passa fermentació hi haurà alcalinització de l'mig per l'ús de les peptones, virant de vermell-taronja a vermell fort.
Derivats proteics (extracte de llevat, extracte de carn, peptona i proteosa peptona)
Quan els bacteris metabolitzen les proteïnes presents en l'agar TSI, es produeixen amines que alcalinitzen el medi (principalment a nivell de l'bisell), a causa de que la reacció necessita oxigen. Les amines fan virar el bisell a vermell fort.
Però això dependrà de la capacitat que tinguin els bacteris de fermentar o no els carbohidrats.
Fermentació de carbohidrats (glucosa, lactosa i sacarosa)
L'estudi de la fermentació de sucres pot donar diverses imatges i cadascuna s'interpreta de manera diferent. La interpretació de la prova divideix els microorganismes en 3 categories: no fermentadors de glucosa, no fermentadors de lactosa i fermentadors de lactosa / sacarosa.
Cal destacar que la quantitat de glucosa en el medi és limitada, mentre que la concentració de lactosa i sacarosa és 10 vegades més gran.
Els bacteris de la Família Enterobacteriaceae i altres microorganismes fermentadors de glucosa començaran a fermentar aquest sucre per ser el carbohidrat més simple per obtenir energia.
D'altra banda, la lactosa i la sacarosa són carbohidrats complexos que han de ser descompostos i convertits en glucosa perquè puguin entrar a l'cicle d'Embden-Meyerhof.
-Microorganismos no fermentadors de glucosa
Quan el microorganisme inoculat no és capaç de fermentar la glucosa, molt menys podrà fermentar altres carbohidrats. Per tant, aquí no es formen àcids, però hi ha formació d'amines al bisell per la utilització de les peptones.
En aquest cas el bisell vira a un vermell més fort i el fons de l'tub pot quedar sense canvi o pot alcalinizarse també, quedant tot el tub vermell.
Interpretació: K / K vol dir bisell alcalí / fons alcalí o neutre
A la imatge que es troba a l'inici de l'article vegeu la imatge de l'tub D.
Aquest resultat indica que el microorganisme no pertany a la Família Enterobacteriaceae.
-Microorganismos no fermentadors de lactosa / sacarosa
Si el bacteri és capaç de fermentar la glucosa però no la lactosa ni la sacarosa, passarà el següent:
El bacteri consumirà tota la glucosa present a el cap de 6 a 8 hores aproximadament, sent capaç d'acidificar tant el bisell com el tac; és a dir, l'agar hi haurà virat completament a groc. Però a l'esgotar-se la glucosa i davant la impossibilitat d'utilitzar la lactosa i la sacarosa, el bacteri començarà el metabolisme de les proteïnes.
Aquesta reacció necessita oxigen, per això la degradació de les peptones es dóna a la superfície (bisell). Les amines produïdes alcalinitzen el bisell virant de color groc a vermell. Aquesta reacció és evidenciada a les 18 a 24 hores d'incubació.
Interpretació: K / A significa bisell alcalí i tac àcid.
A la imatge que es troba a l'inici de l'article vegeu la imatge de l'tub B.
-Microorganismos fermentadors de lactosa / sacarosa
Els microorganismes capaços de fermentar la lactosa i la sacarosa òbviament poden fermentar la glucosa. Després que la mínima quantitat de glucosa present en el medi s'esgota, el piruvat format es comença a metabolitzar per formar àcids a través de l'cicle aeròbic de Krebs, i en el període de 8 a 12 hores tot el medi estarà groc.
Si el bacteri és capaç de desdoblar la lactosa o la sacarosa, se seguiran produint àcids, i a el cap de 18 a 24 hores tot el tub -bisel i taco- continuaran grocs.
Cal destacar que la utilització de la glucosa es realitza de dues maneres: una en forma aeròbia al bisell de el tub, i l'altra de forma anaeròbia en el fons de l'tub.
Interpretació: A / A significa bisell àcid / fons àcid. Pot presentar gas o no.
A la imatge que es troba a l'inici de l'article vegeu la imatge de l'tub A.
Producció de gas
Alguns microorganismes són capaços de produir gas durant la fermentació dels sucres. El gas s'evidencia en el tub per la pressió que aquest exerceix dins de l'agar. La pressió origina la formació de bombolles o el desplaçament de l'agar. En ocasions la formació de gas pot fracturar el medi.
És important que a l'hora de sembrar el medi TSI, la punció es faci netament pel centre de l'agar fins arribar a al fons. Si la punció es desvia cap a les parets de l'tub, pot causar falsos positius en la producció de gas, ja que el mateix escaparà pel canal format erròniament.
La producció de gas, així com les reaccions que ocorren en el bisell de l'agar, necessiten oxigen, per tant es recomana que el tub sigui tapat amb tap de cotó, i si es fa servir tapa de baquelita, aquesta no ha d'estar ajustada completament.
La producció de gas es reporta com a positiva (+) o negativa (-).
Patrons de formació de gas. Font: Esquema realitzat per MSc. Marielsa Gil. Font de les imatges: VeeDunnFlickr.com/Y_tambe, via Wikimedia Commons
Tiosulfat de sodi i sulfat ferrós d'amoni
Els bacteris capaços de produir sulfur d'hidrogen (gas incolor), prenen el sofre de l'tiosulfat de sodi present en el medi. Un cop format el H 2 S reacciona amb el sulfat ferrós d'amoni, produint sulfur de ferro (precipitat negre clarament visible).
La producció d'H 2 S es reporta com a positiva (+) o negativa (-).
A la imatge que es troba a l'inici de l'article vegeu la imatge de l'tub C.
preparació
Malgrat 62,5 gr de medi agar ferro triple sucre (TSI) deshidratat i dissolgui en un litre d'aigua destil·lada.
Calent fins dissoldre completament l'agar. Bullir per un minut agitant freqüentment. Distribuir 4 ml de medi en tubs d'assaig 13/100 amb tapa de cotó.
Esterilitzar en autoclau a 121 ° C per 15 minuts. Eliminar de l'autoclau i deixar reposar de forma inclinada. S'ha de tenir cura que tant la base com el bisell tinguin la mateixa distància.
Emmagatzemar en nevera 2-8 ° C. Deixar temperar abans de sembrar la soca bacteriana.
El color de l'mig deshidratat és beix clar i el medi preparat és de color vermell-taronja
El pH final de l'medi preparat és 7,3 ± 0,2.
usos
La prova TSI és molt utilitzada a nivell de laboratori de microbiologia. Aquesta prova resulta indispensables per orientar el tipus de prova que s'ha d'aplicar per arribar a la identificació de l'gènere i espècie. La seva bona execució i interpretació pot fer estalviar material i treball.
Si el resultat és un TSI K / K i la prova citocrom oxidasa dóna positiu, se sap que han d'usar-proves per a la identificació de bacils Gram negatius no fermentadors, com ara Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Burkholderia, entre altres gèneres. Si és oxidasa negatiu s'orienta cap als gèneres Acinetobacter, Stenotrophomonas, etc.
En canvi, si s'obté un TSI A / A o K / A i la prova citocrom oxidasa és negativa, més redueixen els nitrats a nitrits, tindrem certesa que es tracta d'un microorganisme pertanyent a la Família Enterobacteriaceae. En aquest cas la ruta d'identificació s'orientarà a proves específiques per a aquest grup de bacteris.
D'altra banda, si s'obté una imatge K / A o A / A i la prova citocrom oxidasa és positiva, les proves addicionals a muntar aniran dirigides a la identificació de soques fermentadors que no pertanyen a la Família Enterobacteriaceae, com ara: Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio i Pasteurella.
Un TSI amb sulfur d'hidrogen, oxidasa negativa, s'orientarà a la identificació dels següents gèneres de la Família Enterobacteriaceae: Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Leminorella, Pragia, Trabusiella o Salmonella.
Un TSI amb sulfur d'hidrogen escàs o moderat en el bisell alcalí amb fons alcalí i una oxidasa positiva, orientarà a utilitzar proves per a la identificació de bacils Gram negatius no fermentadors productors d'H 2 S, tal com Shewanella putrefaciens.
Finalment, el TSI pot ser utilitzat per a la investigació de la producció de sulfur d'hidrogen en bacils Gram positius, especialment quan es sospita d'Erysipelothrix rhusiopathiae.
sembrat
El medi TSI ha de ser inoculat amb colònies pures, aïllades en cultius primaris o selectius. Si la colònia es pren de mitjans selectius que van ser sembrats amb mostres amb flora mixta, s'ha de tenir la cura de prendre només de la superfície, ja que a la part inferior de la colònia poden existir ceps viables inhibides en aquest mitjà.
Per tant, no s'ha de mai refredar la nansa en un medi selectiu per després prendre la colònia i inocular un mitjà TSI.
El sembrat es realitzarà amb un ansa recta o agulla. Es realitzarà una punció, tenint cura que sigui pel centre de l'mig fins arribar a el fons, i després s'acaba el sembrat inoculant la superfície en forma de ziga-zaga. No fer dues puncions.
Incubar a 37 ° C a aerobiosi per 18-24 hores. Interpretar en aquest temps, ni abans, ni després.
limitacions
La prova de TSI s'ha de llegir entre 18 a 24 hores d'incubació. Una lectura abans d'aquest temps pot donar un fals positiu de fermentació A / A. En tant que, un lectura posterior a aquest temps, pot donar lloc a una imatge falsa negativa de no fermentador, a causa de el consum de les peptones que alcalinitzen el medi.
referències
- Mac Faddin J. (2003). Proves bioquímiques per a la identificació de bacteris d'importància clínica. 3era ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnòstic Microbiològic de Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
- Köneman I, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnòstic Microbiològic. 5ta ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
- «Agar TSI.» Viquipèdia L'enciclopèdia lliure. 10 jul 2018, 08:09 UTC. 10 feb 2019, 03:33 Disponible a: es.wikipedia.org
- Laboratoris Britània. TSI Agar (Triple sugar iron agar). 2015. Disponible a: britanialab.com
- Laboratoris BD. Triple sugar iron agar (TSI Agar). 2003. Disponible a: bd.com