L' agar TCBS és un mitjà de cultiu sòlid altament selectiu i diferencial, utilitzat per a l'aïllament i cultiu de bacteris de l'gènere Vibrio, especialment Vibrio cholerae, V. vulnificus i V. parahaemolyticus com a principals patògens d'aquest gènere.
Les sigles TCBS signifiquen tiosulfat citrat bilis sacarosa. A aquest agar també se li coneix amb el nom de mig selectiu per vibris. La fórmula original va ser creada per Nakanishi i posteriorment modificada per Kobayashi.
Medi TCBS comercial i placa d'agar TCBS sembrada amb Vibrio cholerae. Font: foto 1: presa per l'autora MSc. Marielsa Gil / Foto 2: Microrao, JJMMC, Davangere, Karnataka, Índia
Està compost per extracte de llevats, peptona de carn, tripteína, citrat de sodi, tiosulfat de sodi, bilis de bou, sacarosa, clorur de sodi, citrat fèrric, blau de bromotimol, blau de timol i agar.
Aquesta composició permet un adequat desenvolupament de les espècies de Vibrio a partir de mostres d'aigües, aliments i excrements; a excepció de Vibrio hollisae, que no creix en aquest mitjà. A més, el mitjà TCBS és capaç d'inhibir el creixement d'altres bacteris acompanyants, especialment coliformes.
A causa dels greus problemes gastrointestinals i extra-intestinals que produeixen algunes espècies de l'gènere Vibrio, el seu diagnòstic és molt important. L'humà s'infecta principalment pel consum d'aliments crus o poc cuits de la mar o aigües contaminades, però també a través de la infecció de ferides.
A causa d'això, els laboratoris clínics han d'incloure l'agar TCBS en l'estudi de coprocultius de mostres d'excrements líquids, especialment amb aspecte d'aigua d'arròs. Especialment si el pacient refereix haver estat en contacte amb aigua de mar o haver consumit mariscs o peixos.
fonament
L'extracte de llevats, les peptones de carn, i la tripteína, són la font nutritiva d'aquest mitjà. No obstant això, l'agar TCBS és un mitjà inhòspit per a la majoria dels bacteris.
La seva alta selectivitat ve donada per l'agregat de citrat de sodi i bilis de bou; tots dos són agents inhibidors que a més proporcionen un pH alcalí a l'mig, restringint el creixement de la flora acompanyant i afavorint el creixement de V. cholerae, entre altres espècies. Cal destacar que Vibrio cholerae és molt sensible a l'acidesa.
Per la seva banda, el clorur de sodi equilibra osmòticament a el medi. A més com la seva concentració és alta, també actua com un agent inhibidor, afavorint el creixement de bacteris halòfiles.
La sacarosa és el sucre fermentable que al costat dels indicadors de pH blau de bromotimol i blau de timol li donen el caràcter diferencial a l'mig. Per tal motiu, amb aquest mitjà és possible diferenciar les soques fermentadoras de sacarosa de les no fermentadoras.
Les colònies dels ceps fermentadoras de sacarosa es desenvolupen de color groc i faran virar el mitjà de verd a groc per la producció d'àcids. Les no fermentadoras creixen translúcides i el medi queda de la color original (verd).
Així mateix, aquest mitjà conté tiosulfat de sodi com a font de sofre i citrat fèrric com a agent revelador. Tots dos evidencien als bacteris capaços de produir sulfur d'hidrogen (gas incolor). El H 2 S es forma a partir de l'tiosulfat i posteriorment a l'reaccionar amb el citrat fèrric es forma un precipitat negre visible.
Finalment, l'agar és el que proporciona la consistència sòlida a l'mig.
preparació
Malgrat 89 gr de el medi deshidratat i dissolgui en un litre d'aigua destil·lada. Ajudeu la dissolució per escalfament i agitació freqüent. La barreja pot deixar-se bullir fins per 2 minuts.
Aquest mitjà no es autoclava. Després de la seva dissolució es serveix directament sobre plaques estèrils. A l'solidificar s'ordenen de forma invertida en plaqueros i es guarden a la nevera (2-8 ° C) fins al seu ús.
El mig després de preparat ha de quedar a pH 8,6 ± 0,2.
El color de l'mig deshidratat és de color beix clar o beix-verdós, i el color de l'mitjà és verd bosc o verd blavós.
És important deixar temperar les plaques abans de sembrar les mostres.
ús
La mostra més comuna per a l'aïllament de vibris són la femta diarreiques.
Les mostres de femta si no poden ser sembrades immediatament en el medi selectiu, han de transportar-en el medi de Cary Blair.
Per augmentar la sensibilitat de l'cultiu, la femta poden ser passades per aigua peptonada a pH 8,4 com a mitjà d'enriquiment durant 8 hores màxim, d'allí es subcultiva a el medi TCBS.
També cal tenir en compte que algunes soques de vibris poden causar septicèmies en pacients inmunosuprimidos, per tant poden aïllar-se de hemocultius. Així mateix, poden analitzar-se mostres d'aigües i aliments provinents de la mar, quan hi ha brots epidèmics de la malaltia de còlera.
sembrat
El inòcul de la mostra en estudi ha de ser prominent, el sembrat es realitza pel mètode de estriació per esgotament. Les plaques s'incuben a 37 ° C per 24 hores en aerobiosi.
Les colònies presumptives de Vibrio cholerae són de grandària mitjana, llises, opaques, de vores prims i de color grogues a causa de que fermenten la sacarosa.
De manera similar creixen les espècies de V. alginolyticus, V. fluvialis, V. hareyi, V. cincinnatiensis, V. furnissii, V. metschnikovii i alguns V. vulnificus. Altres espècies de vibrions clínicament importants com V. parahaemolyticus no fermenten la sacarosa, desenvolupant-se com colònies verd oliva.
Placa agar TCBS sembrada amb Vibrio parahaemolyticus. Font: isis325 Flickr
D'altra banda, cal tenir present que algunes soques de Aeromonas i Plesiomonas que són oxidasa (+) poden créixer en aquest mitjà, desenvolupant colònies grogues que poden confondre el clínic. Mentre que algunes soques de Pseudomonas també oxidasa (+) creixen com colònies verds a l'igual que V. parahaemolyticus.
limitació
La prova de l'oxidasa que és positiva per al gènere Vibrio mai s'ha de fer a partir de colònies obtingudes de l'agar TCBS, ja que el resultat obtingut serà un fals negatiu. Els compostos de l'mig interfereixen fortament en aquesta prova. Per tant, s'ha de fer a partir d'subcultius en agar sang.
Control de qualitat
Per provar que el medi està en bones condicions és recomanable sembrar ceps controls conegudes o certificades, i observar si el creixement compleix amb les característiques esperades.
Per a això es poden utilitzar ceps de:
-Vibrio cholerae - creixement satisfactori (colònies grogues, vora translúcid).
-Vibrio parahaemolyticus --- creixement satisfactori (colònia amb centre verd i vora translúcida).
-Vibrio alginolyticus ATCC 17749 - creixement satisfactori (colònies grogues amb halos de el mateix color al voltant de la colònia).
-Enterococcus faecalis ATCC 29212 - inhibició total o parcial (colònies petites grogues o translúcides).
-Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853-- inhibició parcial o total (colònies blaves).
-Escherichia coli ATCC 25922 - Inhibit completament.
-Proteus mirabilis ATCC 43071 - Inhibició total o parcial. (Petites colònies centre verd vora translúcid).
La incubació d'un mitjà sense inocular no ha de tenir canvi.
referències
- Laboratoris Difco Francisco Soria Melguizo. TCBS agar. 2009. Disponible a: f-soria.es
- Laboratori BD. BD. TCBS Agar 2003. Disponible a: bd.com
- Laboratoris Britània. TCBS Mitjà. 2015. Disponible a: britanialab.com
- Laboratoris Acumedia. TCBS Agar. 2016. Disponible a: foodsafety.neogen.com
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnòstic Microbiològic de Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
- Köneman I, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnòstic Microbiològic. 5ta ed. Editorial Panamericana SA Argentina.