AGAR SABOURAUD: FONAMENT, PREPARACIÓ I USOS - BIOLOGIA - 2025

El agar Sabouraud, també conegut com agar dextrosa Sabouraud, és un mitjà de cultiu sòlid, especialment enriquit per a l'aïllament i desenvolupament de fongs, com llevats, floridures i dermatòfits.

Per tant, aquest mitjà no pot faltar en un laboratori de microbiologia per investigar la presència de fongs patògens o oportunistes, bé sigui de mostres clíniques o no clíniques. Igualment, també és ideal per al creixement de bacteris filamentosos com Streptomices i Nocardias. El seu ús és molt ampli, ja que pot ser emprat en la micologia humana, animal, vegetal i industrial.

A. Agar Sabouraud sense sembrar. B. Agar Sabouraud sembrada amb un llevat. Font: Fotos preses per l'autora MSc. Marielsa Gil

Aquest mitjà va ser creat el 1896 pel destacat metge dermatòleg Raimond Sabouraud, que va arribar a ser un especialista reconegut mundialment en desordres de l'cuir cabellut, principalment causats per dermatòfits.

La seva creació va ser tan important que ha estat usat des de llavors i es manté en l'actualitat, encara que amb algunes modificacions.

Encara que és especial per fongs, en aquest mitjà poden créixer bacteris, per tant per a mostres amb flora mixta es requereix la inclusió d'antibiòtics en la seva preparació i així inhibir el creixement de la flora bacteriana que pugui estar present.

L'elecció de l'antibiòtic s'ha de fer amb cura i tenint en compte el tipus de fong que es vol recuperar, ja que alguns s'inhibeixen en presència de certes substàncies.

fonament

L'agar dextrosa Sabouraud és un mitjà que en la seva formulació original és feblement selectiu, per la seva pH àcid de 5.6 ± 0.2, però tot i així els bacteris poden desenvolupar-se, principalment en incubacions perllongades.

El medi conté peptona de caseïna i digerit pancreàtic de teixit animal, que proporcionen la font de carboni i nitrogen per al desenvolupament dels microorganismes.

També conté alta concentració de glucosa, que actua com a font d'energia afavorint el creixement dels fongs per sobre dels bacteris. Tot això barrejat amb agar-agar, component que li brinda la consistència adequada.

D'altra banda, l'agar dextrosa Sabouraud pot ser selectiu si se li afegeix antibiòtics.

Amb antibiòtics és especialment útil en mostres de ferides, úlceres obertes o qualsevol mostra en què se sospiti gran contaminació bacteriana.

Combinacions més utilitzades d'agar dextrosa Sabouraud amb antibiòtics

-Agar Sabouraud amb cloramfenicol: ideal per recuperar llevats i fongs filamentosos.

-Agar Sabouraud amb gentamicina i cloramfenicol: en aquest mitjà creixen gairebé tots els fongs filamentosos i llevats, i inhibeix una gran quantitat de bacteris, entre elles Enterobacterias, Pseudomonas i Staphylococcus.

-Agar Sabouraud amb cycloheximide: és especialment útil per a mostres procedents de pell o de l'tracte respiratori, sempre que la sospita sigui de fongs dimórficos.

El cycloheximide s'ha d'utilitzar amb precaució; si bé es fa servir per inhibir el creixement de fongs i llevats no patògens o ambientals que puguin estar presents com a contaminants en una mostra, també inhibeix el creixement d'alguns fongs com Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp i altres fongs oportunistes.

-Agar Sabouraud amb cloramfenicol més cycloheximide: s'usa principalment per aïllar dermatòfits i fongs dimórficos. Té l'inconvenient que inhibeix algunes espècies de fongs oportunistes com Candida no albicans, Aspergillus, zigomicetos o C. neoformans.

-Agar Sabouraud amb cloramfenicol, estreptomicina, penicil·lina G i cycloheximide: és ideal per a mostres extremadament contaminades amb bacteris i fongs sapròfits, però té l'inconvenient que inhibeix el creixement de Actinomyces i Nocardias, a més dels fongs oportunistes esmentats anteriorment.

preparació

Si es compten amb els ingredients per separat es pot preparar de la següent manera:

Agar dextrosa Sabouraud

pesar:

- 40 gr de dextrosa

- 10 g de peptona

- 15 gr d'agar-agar

- Mesurar 1000 ml d'aigua destil·lada

Es barregen tots els ingredients, s'ajusta el pH a 5,6. Es procedeix a dissoldre els soluts mitjançant ebullició, es distribueix 20 ml d'el medi en tubs de 25 x 150 mm, sense vorell i amb tapa de cotó preferiblement.

Tubs amb tapa de cotó. Font: Fotografia presa per l'autora MSc. Marielsa Gil

També es poden fer servir altres mesures de tubs, segons la disponibilitat.

Es porten a l'autoclau durant 10 minuts a una atmosfera de pressió (121 ° C). No ha d'excedir en el temps de autoclavado. A l'sortir de l'autoclau s'inclinen els tubs amb ajuda d'un suport fins que solidifiquin en bec de flauta.

Una altra forma és dissoldre els ingredients per escalfament fins que bulli. En la mateixa fiola autoclavar durant 10 minuts i posteriorment distribuir 20 ml en plaques de Petri.

Si es disposa d'un mitjà agar dextrosa Sabouraud que ja conté tots els ingredients, es procedeix a pesar la quantitat que especifiqui la casa comercial per a un litre d'aigua. La resta dels passos és igual als descrits anteriorment.

Agar dextrosa Sabouraud (modificació de Emmons)

pesar:

- 20 gr de dextrosa

- 10 g de peptona

- 17 gr d'agar-agar

- Mesurar 1000 ml d'aigua destil·lada

Es barregen tots els ingredients, s'ajusta el pH a 6,9. Procedir de la mateixa manera d'el cas anterior.

Hi ha cases comercials que ofereixen el medi amb tots els ingredients. En aquest cas, pesar i preparar d'la manera com el descriu l'insert.

Agar dextrosa Sabouraud (modificació de Emmons) amb cloramfenicol

Solució mare de cloramfenicol

- Pesar 500 mg de cloramfenicol base

- Mesurar 100 ml d'etanol a l'95%

- Barrejar

El medi agar dextrosa Sabouraud (Emmons) es prepara com ja va ser descrit i addicionalment per cada litre de medi afegir 10 ml de solució mare de cloramfenicol abans de autoclavar.

Agar dextrosa Sabouraud Emmons amb cycloheximide

Solució mare de cycloheximide

- Pesar 5 gr de cycloheximide

- Mesurar 100 ml d'acetona

- Barrejar

El medi agar dextrosa Sabouraud (Emmons) es prepara com ja va ser descrit i addicionalment per cada litre de medi afegir 10 ml de solució mare de cycloheximide abans de autoclavar.

Agar dextrosa Sabouraud (Emmons) amb cloramfenicol i cycloheximide

El medi agar dextrosa Sabouraud (Emmons) es prepara com ja va ser descrit i addicionalment per cada litre de medi afegir 10 ml de solució mare de cloramfenicol i 10 ml de solució mare de cycloheximide abans de autoclavar.

Altres antibiòtics que poden ser afegits

20.000 de 60.000 unitats de penicil·lina per litre de medi.

30 mg d'estreptomicina per litre de medi.

Tots dos han de ser incorporats després de autoclavado el medi, lleugerament refredat (50-55 ° C).

0,04 g de neomicina per litre de medi.

0.04 g de gentamicina per litre de medi.

consideracions especials

Per seguretat es prefereix sembrar agar dextrosa Sabouraud en tubs en forma de falca (inclinat en bec de flauta) abans que en plaques de Petri, per evitar la dispersió i inhalació de les espores.

És important que els tubs amb agar Sabouraud es tapin amb cotó i no amb tapa de rosca, ja que s'ha demostrat que les condicions semianaeróbicas inhibeixen la formació d'esporos en algunes soques, per exemple de Coccidioides immitis. A més, la majoria dels fongs són aerobis.

En cas d'usar tapa de rosca, no tancar hermèticament.

Control de qualitat

Als mitjans preparats se'ls ha de fer control de qualitat per verificar el seu bon funcionament. Per a això es sembren certes soques controls.

Per agar dextrosa Sabouraud amb cloramfenicol es poden usar ceps ATCC de Candida albicans, el qual ha de tenir un excel·lent creixement. Una altra placa s'inocula amb soques d'Escherichia coli, havent de ser inhibit completament.

També es incuba una placa sense inocular en la qual no ha de créixer cap microorganisme.

Per agar dextrosa Sabouraud amb cloramfenicol i cycloheximide es poden usar ceps de Trichophyton mentagrophytes, havent de desenvolupar-se bé. Una altra placa s'inocula amb un cep d'Aspergillus flavus, en el qual hi ha d'haver creixement escàs o no creixement. A més a s'incuba una placa sense inocular per demostrar la seva esterilitat.

Per agar dextrosa Sabouraud amb cycloheximide s'usen ceps de Càndida albicans, Trichophyton rubrum o Microsporum canis, els quals han de demostrar bon creixement.

Així mateix, s'inclou un cep d'Aspergillus flavus, demostrant creixement escàs o no creixement. Finalment incubar una placa sense inocular per a control d'esterilitat.

usos

cultiu primari

L'agar dextrosa Sabouraud clàssic conté 4 g de dextrosa i és excel·lent com a mitjà primari d'aïllament, ja que mostra la morfologia característica de cada fong.

A més és excel·lent per demostrar la producció de pigments. No obstant això, no és el mitjà més adequat per observar la esporulació.

Tampoc està recomanat per conrear a Blastomyces dermatitidis, el qual és inhibit per l'alta concentració de glucosa present.

D'altra banda, per al cultiu s'han de tenir present certes consideracions.

Alguns fongs es desenvolupen millor a temperatura ambient, com les floridures, altres es desenvolupen amb èxit a 37 ° C, com alguns llevats, i altres poden desenvolupar-se a les dues temperatures (fongs dimórficos).

Per això, a vegades és necessari utilitzar diverses plaques d'agar Sabouraud per a una mateixa mostra, ja que amb freqüència es realitzen sembrats per duplicat per incubar una placa a temperatura ambient i una altra a 37 ° C.

Per exemple, Sporothrix schenckii es sembra en dues plaques; 1 s'incuba a temperatura ambient per obtenir la fase de floridura i l'altra s'incuba a 37 ° C per obtenir la fase levaduriforme, però en aquesta última cal afegir 5% de sang a l'mig.

En altres casos, com en mostres de micetomes, se sembren dues plaques d'agar Sabouraud, una amb cloramfenicol i una altra amb cycloheximide. La primera permetrà el creixement d'agents causals de micetoma d'origen micòtic (Eumicetoma) i la segona agents causals de micetomes d'origen bacterià, com els actinomicetomas.

esporulació

L'agar dextrosa Sabouraud modificat per Emmons conté 2 g de dextrosa i no només serveix per a l'aïllament, sinó també per a la esporulació i conservació dels fongs.

En aquest mitjà si es poden recuperar ceps de Blastomyces dermatitidis.

conservació

Per conservar els cultius de fongs es poden guardar en nevera (2-8 ° C). El temps de conservació pot variar entre 2 a 8 setmanes. Després d'aquest temps han subcultivarse per repetir el procés.

Alguns fongs es mantenen millor a temperatura ambient, com Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum i Microsporum audounii.

Es pot allargar el manteniment del cep per evitar el pleomorfisme si s'elimina per complet la dextrosa de l'agar i si es disminueix la quantitat d'agar a l'mitjà per evitar la sequedat.

microcultius

Per a la identificació d'alguns fongs filamentosos cal fer microcultius utilitzant agar Sabouraud o altres mitjans especials per observar les estructures de reproducció sexual i asexual.

En micologia humana

És usat principalment per al diagnòstic de malalties micòtiques, especialment aquelles que afecten la pell i els seus annexos (pèl i ungles).

Les mostres poden ser secrecions, exsudats, pell, pèls, ungles, esput, LCR o orina. Els patògens comunament aïllats són dermatòfits, fongs causants de micosis subcutànies i sistèmiques.

micologia animal

Els animals sovint són afectats per infeccions micòtiques, per tant l'agar Sabouraud és tan útil a la micologia animal com en la humana.

Per exemple, sovint els dermatòfits poden afectar els animals. Tal és el cas de Microsporum canis var distortum, que infecta amb freqüència a gossos, gats, cavalls, porcs i micos. Així mateix, Microsporum gypseum infecta gossos, gats i bestiar.

Les aus com gallines, galls i pollastres queden afectades per Microsporum gallinae.

Altres fongs, com Zymonema farciminosum, també són causa de malaltia en animals, principalment en cavalls, mules i ases, produint una inflamació important en els vasos limfàtics.

Sporothrix schenkii i Histoplasma capsulatum afecten animals domèstics i humans.

micologia ambiental

Molts fongs patògens o oportunistes poden concentrar-se en un moment donat en un ambient determinat, especialment en quiròfans i Unitats de Cures Intensives (UCI) de clíniques i hospitals. Per tant és necessari realitzar un control dels mateixos.

Altres espais vulnerables són les biblioteques i edificis vells, els quals es poden veure afectats per la concentració de fongs ambientals.

En estudis d'ambient s'utilitza l'agar dextrosa Sabouraud per a l'aïllament dels fongs.

micologia industrial

L'agar dextrosa Sabouraud no pot faltar per a l'estudi de fongs contaminants en la producció de cosmètics, aliments, begudes, cuirs, tèxtils, entre d'altres.

micologia vegetal

Les plantes també pateixen malalties causades per fongs, afectant diferents parts de la planta, que fins i tot poden acabar amb la collita, provocant grans pèrdues en l'agricultura.

referències

1. Conca M, Gadea I, Martín I, Pemán J, Pontón J, Rodríguez (2006). Diagnòstic microbiològic de les micosis i estudis de sensibilitat als antifúngics. Recomanacions de la Societat Espanyola de Malalties Infeccioses i Microbiologia Clínica. Disponible a: coesant-seimc.org
2. Laboratori ValteK. (2009). Agar Sabouraud dextrosa amb cycloheximida. Disponible a: andinamedica.com.
3. Navarro O. (2013). Micologia veterinària. Universitat Nacional Agrària. Nicaragua.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnòstic Microbiològic de Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA
5. Cases-Racó G. Micologia General. 1994. 2n Ed. Universitat Central de Veneçuela, Edicions de biblioteca. Veneçuela, Caracas.