- fonament
- preparació
- usos
- Tècnica de l'antibiograma
- Col·locació estratègica de discos sobre l'agar Müeller Hinton
- Causes de resultats erronis
- limitació
- Control de qualitat
- referències
El agar Müeller Hinton és un mitjà nutritiu sòlid, no selectiu, que està compost per infusió de carn, peptona àcida de caseïna, midó, agar i aigua destil·lada. Aquest mitjà permet un excel·lent desenvolupament microbià de la majoria dels bacteris de creixement ràpid.
Originalment va ser creat per John Howard Müeller i Jane Hinton per aïllar bacteris exigents des del punt de vista nutricional, com Neisseria gonorrhoeae i Neisseria meningitidis. No obstant això, a causa de les seves característiques va resultar ser ideal per a l'estudi de la susceptibilitat als antibiòtics, proporcionant resultats fiables i reproduïbles.
Antibiogrames (agar Müeller Hinton). Font: Dr Graham Beards at en.wikipedia
Per això, l'agar Müeller Hinton és el mitjà de cultiu acceptat per la Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) i European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, per a l'execució de la prova de susceptibilitat antimicrobiana pel mètode de difusió en disc de Kirby i Bauer.
fonament
Per ser un medi nutritiu no selectiu és excel·lent per al creixement de la majoria dels bacteris patògens.
D'altra banda, la seva composició simple fa que les substàncies difonguin fàcilment sobre ell, sent una característica essencial per a la prova de susceptibilitat pel mètode de difusió en disc.
Una altra de les seves característiques és que conté baixa quantitat d'inhibidors, el que permet que puguin avaluar-se de manera efectiva les sulfonamides, el trimetoprim i les tetraciclines.
No obstant això, s'ha de tenir present que el medi ha de complir certes condicions per garantir el seu bon funcionament, entre elles:
L'ajust de el pH, la profunditat de l'agar i la concentració adequada de timina, timidina, Ca ++, Mg ++ i Zn ++.
També cal saber que la metodologia està estandarditzada i per tant s'han de complir tots els paràmetres, com ara:
La concentració de l'inòcul, la concentració i conservació dels discos d'antibiòtics, la col·locació de l'nombre adequat de discos sobre l'agar, la distància entre un disc i un altre, la col·locació estratègica de certs antibiòtics, l'atmosfera, la temperatura i el temps de incubació.
preparació
Pesar 37 g de medi Müeller Hinton deshidratat i dissoldre en 1 litre d'aigua destil·lada. Escalfar el medi mentre s'agita per ajudar a la seva dissolució. Deixar bullir per 1 minut.
Dur a l'autoclau per esterilitzar a 121 ° C per 15 minuts. A l'treure de l'autoclau, s'ha de col·locar la fiola en un bany de maria a 50 ° C a fresc. Abocar 25 a 30 ml en plaques de Petri estèrils de 10 cm de diàmetre.
Les plaques han de quedar amb un gruix mitjana de 4 mm (ideal), sent permès un rang de 3-5 mm.
Si es desitja preparar agar sang usant com a base agar Müeller Hinton, s'aboca 5% de sang de be estèril i desfibrinada abans de servir en les plaques.
El pH final de l'mig ha de quedar entre 7,2 a 7,4.
Invertir i guardar en nevera, fins al seu ús. Deixar que la placa prengui temperatura ambient abans d'utilitzar.
El color de l'medi preparat és beix clar.
usos
S'utilitza per a realitzar l'antibiograma o la prova de susceptibilitat als antibiòtics a la majoria dels patògens no exigents de creixement ràpid.
Si l'agar és suplementat amb sang serveix per realitzar l'antibiograma de microorganismes exigents com: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, entre altres. També ha estat utilitzat per aïllar Legionella pneumophila.
Tècnica de l'antibiograma
Abans de realitzar l'antibiograma s'ha de preparar una solució bacteriana equivalent a 1,5 x 10 8 cèl·lules.
Per a això, es prenen 3 a 4 colònies de l'cultiu pur i se suspenen en un brou soja tripticasa o en brou Müeller Hinton, s'incuba per 2 a 6 hores i s'ajusta la concentració amb solució salina estèril, comparant-ho amb un patró Mac Farland de 0,5%.
Si es tracten de microorganismes exigents es poden suspendre colònies de forma directa fins a arribar a la concentració 0,5% de Mac Farland. Posteriorment, es sembra la placa de Müeller Hinton amb un hisop impregnat amb la solució bacteriana preparada.
Per a això, es submergeix l'hisop en la solució i després es treu l'excés de líquid fent pressió contra les parets de l'tub. Immediatament després es passa el hisop per tota la superfície, sense deixar llocs sense tocar, després es gira lleument la placa i es torna a sembrar. L'operació es repeteix 2 vegades més.
Deixeu reposar per 10 minuts i després poseu els discs d'antibiòtics amb una pinça estèril, deixant un espai de 24 mm entre un i altre. Després de col·locar cada disc sobre l'agar pressioni lleument a cada un amb la pinça per assegurar que quedin ben adherits.
Finalitzat el procés, s'inverteix la placa i s'incuba a 35-37 ° C a aerobiosi per 16 a 18 hores. Si es tracta d'un microorganisme exigent pot ameritar microaerofilia i si l'antibiograma conté discos de oxacilina s'ha de llegir a les 24 hores.
Per mesurar el diàmetre de cada halo s'utilitza una regla. Els resultats s'han d'anotar en mm. Posteriorment es correlacionen els valors obtinguts amb les taules de punts de talls publicades pel manual de la CLSI vigent.
Mesura de l'halo d'inhibició. Font: USCDCP, Pixnio.com
Informar com a sensible (S), intermedi (I), o resistent (R), segons sigui el cas.
Els antibiòtics es seleccionen d'acord a l'microorganisme aïllat i a el tipus d'infecció que està produint.
De vegades s'ha de tenir present la col·locació estratègica d'antibiòtics per evidenciar patrons fenotípics de resistència.
Col·locació estratègica de discos sobre l'agar Müeller Hinton
Per enterobacteris s'ha de col·locar el disc d'àcid clavulànic enfront de cefalosporines de 3r i 4ta generació. Un eixamplament en forma d'ou indica que el cep és productora de betalactamases d'espectre estès (BLEE). Això vol dir que el pacient no ha de ser tractat amb cap cefalosporina.
Expressió fenotípica de producció de betalactamases d'espectre estès (BLEE) en una soca d'Escherichia coli. Font: Fotografia presa per l'autora MSc. Marielsa Gil
En Staphylococcus és important col·locar el disc d'eritromicina o azitromicina davant el disc de clindamicina (prova D-test).
Un halo resistent a eritromicina i un aplatament en l'halo de clindamicina indica que el cep posseeix una resistència induïble a clindamicina, cep (RIC). Això vol dir que un tractament amb clindamicina no serà efectiu.
Per a la recerca de ceps AMP C induïbles en enterobacteris i alguns bacils Gram negatius no fermentadors, s'enfronten els discos de ceftazidime, cefoxitin o piperacil·lina tazobactan davant d'un disc de imipenem, a una distància de 27 mm.
Un halo aplatat en algun dels discos enfrontats a imipenem indica presència d'AMP C induïble.
Per a la recerca d'AMP C constitutiva s'enfronta un disc de cloxacil·lina 500 mg amb ceftazidime (30 mg) i amb cefotaxime (30 mg), a una distància de 25 mm. Un halo eixamplat en alguna de les cefalosporines indica positivitat.
També es pot substituir el disc de cloxacil·lina per un disc de 9 mm de paper de filtre Whatman N ° 6 impregnat amb àcid fenil bòric (400 mg) amb una distància de 18 mm. S'interpreta igual a l'anterior.
Finalment, per investigar la producció de metalobetalactamasas especialment en Pseudomonas aeruginosa, s'utilitza un disc impregnat amb 10 ml d'àcid etilendiamintetraacético (EDTA 750 mg) i àcid tioglicólico (SMA 300 mg), el qual s'enfronta amb els discos de imipenem i meropenem, a una distància de 15 mm.
La prova és positiva si hi ha eixamplament dels halos d'imipenem o meropenem cap al disc d'EDTA / SMA. Aquest resultat s'ha de confirmar pel test d'Hodge modificat.
Aquest mètode consisteix a inocular un cep d'Escherichia coli ATCC 25922 sobre la placa Müeller Hinton. Es col·loca un disc de imipenem al centre de la placa i després es fa una estria des del disc cap a la perifèria amb la soca de P. aeruginosa sospitosa. Es poden provar fins a 4 ceps per placa.
La prova serà positiva si hi ha una zona de distorsió de l'halo de imipenem al voltant de l'estria.
Causes de resultats erronis
-Discos d'antibiòtics mal conservats pot produir falses resistències. Per exemple, el disc de oxacilina és molt vulnerable als canvis de temperatura.
-Un pH de l'mig per sota a l'indicat (àcid) produeix halos més petits en els aminoglicòsids i macròlids (risc de falsa resistència), i halos més grans a la penicil·lina, tetraciclina i novobiocina (risc de falsa sensibilitat).
-Si el pH es troba per sobre de l'indicat (alcalí) s'inverteixen els efectes descrits anteriorment.
-Els mitjans amb concentracions de timina i timidina elevades influeixen reduint significativament els halos d'inhibició de les sulfonamides i el trimetoprim.
-Altes concentracions de calci i magnesi produeixen falses resistència dels aminoglucòsids, polimixina B i tetraciclines enfront de soques de Pseudomonas aeruginosa.
-Baixes concentracions de calci i magnesi produeixen falses sensibilitats dels aminoglucòsids, polimixina B i tetraciclines enfront de soques de Pseudomonas aeruginosa.
-La presència de zinc afecta els resultats dels discos de carbapenems (imipenem, meropenem i ertapenem).
-El gruix de l'mig per sota de 3 mm produeix resultats de falsa sensibilitat, mentre que un gruix per sobre de 5 produirà falsa resistència.
-La mobilització de discos al antibiograma donarà halos deformes, ja que la descàrrega d'antibiòtics és immediata.
- inòculs molt febles afecten els resultats, ja que no hi haurà un creixement uniforme o confluït en l'agar, condició necessària per poder mesurar els halos d'inhibició, a més que els halos poden donar més gran del normal.
-Inóculos massa carregats poden donar halos més petits del normal.
-No respectar la distància entre discos fa que es superposi un halo amb un altre i no es puguin llegir correctament.
-Incubar amb CO 2 augmenta la mida dels halos dels discos de tetraciclina i meticil·lina.
-Incubar a temperatures per sota de 35 ° C produeix halos més grans.
-El agregat de sang disminueix la mida de l'halo de les sulfamides.
limitació
La sensibilitat d'un antibiòtic demostrada en l'antibiograma enfront d'un microorganisme (in vitro) no és garantia que funcionarà in vivo.
Control de qualitat
Per saber si el medi conté la quantitat adequada de timina, s'ha de sembrar un cep d'Enterococcus faecalis ATCC 29212 i provar la susceptibilitat a cotrimoxazol (SXT), el mateix ha de donar un halo igual o> a 20 mm perquè sigui satisfactori.
referències
- «Agar Müller-Hinton.» Viquipèdia L'enciclopèdia lliure. 16 nov 2018, 00:23 UTC. 27 gen 2019, 04:22
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnòstic Microbiològic de Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
- Cona E. Condicions per a un bon estudi de susceptibilitat mitjançant test de difusió en agar. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
- Laboratori Difco Francisco Soria Melguizo. Müeller Hinton agar with 5% sheep blood. 2009. Disponible a:
- Laboratori BD Müeller Hinton II Agar. 2017. Disponible a:.bd.com
- Laboratoris Britània. Müeller Hinton agar. 2015. Disponible a: britanialab.com
- Köneman I, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnòstic Microbiològic. 5ta ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
- Martínez-Rojas D. betalactamases tipus AMPc: Generalitats i mètodes per a detecció fenotípica. Rev. Soc. Vine. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. Disponible a: scielo.org.
- Perozo A, Castellà M, Ling I, Arraiz N. Detecció fenotípica metalobetalactamasas en aïllats clínics de Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Disponible a: scielo.org.