- fonament
- Peptones i extracte de llevat
- glucosa
- L-lisina
- Indicador de pH (porpra de bromocresol)
- Citrat fèrric d'amoni i tiosulfat sòdic
- Interpretació de la prova
- Descarboxilació de la lisina
- Desaminació de la lisina
- Producció de sulfur d'hidrogen (H
- Registre dels resultats
- preparació
- usos
- referències
El agar LIA (Lisina Ferro) és una prova bioquímica utilitzada per a la identificació de bacteris de la família Enterobacteriaceae. Aquest mitjà va ser creat per Edwards i Fife, basats en la fórmula de Falkow.
Originalment aquesta prova era un brou que contenia peptones, extracte de llevat, glucosa, L-lisina, porpra de bromocresol i aigua destil·lada. Edwards i Fife li van agregar agar-agar, citrat fèrric d'amoni i tiosulfat sòdic.
Prova positiva i negativa de la descarboxilació de la lisina. Font: Fotografia i esquema propietat de l'autora MSc. Marielsa Gil
La prova consisteix bàsicament en demostrar la presència de l'enzim lisina descarboxilasa, capaç de reaccionar amb el grup carboxil de l'aminoàcid L-lisina. També pot ocórrer una desaminació de l'aminoàcid per la presència de l'enzim lisina desaminasa.
Addicionalment, la composició de l'mitjà permet evidenciar la capacitat d'alguns gèneres bacterians de produir sulfur d'hidrogen. Finalment, també és possible observar la generació o no de gas en el medi.
fonament
Peptones i extracte de llevat
Com la majoria dels mitjans de cultius, l'agar ferro lisina conté components que proporcionen la font de nutrients necessàries per al creixement bacterià. Aquests components estan representats per les peptones i l'extracte de llevat.
glucosa
Així mateix, aquest agar conté com carbohidrat fermentable la glucosa. Se sap que tots els bacteris de la família Enterobacteriaceae fermenten la glucosa.
Aquest pas és crucial, perquè s'encarregarà d'acidificar el medi, condició indispensable perquè l'enzim lisina descarboxilasa -si està present- actuï sobre el seu substrat.
En alguns gèneres bacterians es pot observar la producció de gas a causa de la fermentació de la glucosa.
El gas s'evidencia quan ocorre un desplaçament de l'agar en el tub, quedant un espai buit en el fons d'ell mateix, o per fractura de l'mig en dues o més porcions.
L-lisina
Un cop descarboxilada la lisina, es forma una diamina (cadaverina) i anhídrid carbònic.
La descarboxilació es dóna en presència del coenzim fosfat de piridoxal. Aquesta reacció és irreversible.
Indicador de pH (porpra de bromocresol)
Tots els canvis de pH ocorreguts en el medi per les diverses reaccions, són detectats per l'indicador de pH porpra de bromocresol.
En aquest sentit, quan hi ha acidificació el medi es torna groc, i quan hi ha alcalinització el medi torna a la color morat o porpra original.
Quan ocorre desaminació de la lisina per la presència de l'enzim lisina desaminasa, es forma un color vermellós a la superfície, típic en els gèneres Proteus, Providència i algunes espècies de Morganella.
Això es deu al fet que durant el procés de desaminació es forma l'àcid alfa-ceto-carbònic, que reacciona amb el citrat d'amoni en presència d'oxigen, la qual cosa origina el color esmentat.
Citrat fèrric d'amoni i tiosulfat sòdic
D'altra banda, els bacteris que produeixen sulfur d'hidrogen quedaran en evidència per la presència de l'tiosulfat sòdic (font de sulfur) i de l'citrat fèrric d'amoni, que és el revelador de l'H 2 S.
Els bacteris que posseeixin l'enzim tiosulfat reductasa tenen la capacitat d'actuar reduint el tiosulfat de sodi present, formant sulfit i sulfur d'hidrogen (H 2 S).
Aquest últim és un gas incolor, però a l'reaccionar amb la sal de ferro forma sulfur ferrós metàl·lic, que és un compost insoluble (precipitat negre visible).
No obstant això, la capacitat de formació d'H 2 S amb aquest mitjà no és molt fiable, a causa de que alguns bacteris lisina descarboxilasa negatives capaços de produir H 2 S no formaran el precipitat negre, ja que l'acidesa de l'mig interfereix. Per això es recomana corroborar amb altres mitjans que continguin ferro.
Interpretació de la prova
Descarboxilació de la lisina
Els tubs s'han de llegir després de culminades les 24 hores d'incubació, en cas contrari es corre el risc de mal interpretar la reacció, reportant falsos negatius.
Cal recordar que la primera reacció que passarà serà la fermentació de la glucosa, per tant tots els tubs a l'cap de 10 a 12 hores viraran a color groc.
Si a l'acabar el temps d'incubació (24 hores) s'observa un fons groc amb una superfície habitada o porpra, la reacció és negativa. El color porpra de la superfície correspon a la alcalinització de l'mig per l'ús de les peptones.
Una reacció positiva és aquella on el fons i la superfície de l'tub són completament porpres, és a dir, torna a l'color original.
Per tant, qui determina la positivitat de la prova és la base o fons de l'mig. Si es té dubte sobre el color es pot comparar amb un tub de LIA no inoculat.
Desaminació de la lisina
Un tub que evidencia la desaminació de la lisina tindrà una superfície color rogenca granat i un fons groc (àcid), o tot el tub color vermellós granat.
Aquesta reacció s'interpreta com negativa per a la descarboxilació de la lisina, però positiva per desaminació de la lisina.
Aquesta reacció es defineix i interpreta al bisell.
Producció de sulfur d'hidrogen (H
Una reacció positiva s'observa per l'aparició d'un precipitat negre en tot el mitjà o part d'ell. Generalment entre el límit de l'bisell i la base.
Si el precipitat es dóna en tot el tub no deixarà veure les altres reaccions que ocorren en el medi.
Registre dels resultats
A l'interpretar la prova els resultats es registren de la següent manera:
Primer es llegeix el bisell, després el fons o tac, després la producció d'H 2 S, i finalment la producció de gas.
Exemple: K / A + (-). Això vol dir:
- K: Bisell alcalí (color morat)
- A: Fons àcid (groc), és a dir, reacció de descarboxilació negativa i desaminació negativa.
- +: Producció de sulfur d'hidrogen
- (-): Sense gas.
preparació
Malgrat 35 gr de medi lisina agar ferro deshidratat i dissolgui en un litre d'aigua destil·lada.
Calent fins dissoldre completament l'agar, per això deixi bullir per un minut agitant freqüentment. Distribuir 4 ml de medi en tubs d'assaig 13/100 amb tapa de cotó.
Esterilitzar en autoclau a 121 ° C per 15 minuts. Eliminar de l'autoclau i deixar reposar de forma inclinada, de manera que quedi una base profunda i un bisell curt.
Emmagatzemar en nevera 2-8 ° C. Deixar temperar abans de sembrar la soca bacteriana.
El color de l'mig deshidratat és beix i de l'mig preparat color porpra vermellós.
El pH final de l'medi preparat és 6,7 ± 0.2
El medi es torna groc amb pH igual o menor a 5,2, i és morat a pH 6,5 cap amunt.
usos
Aquesta prova, al costat d'altres proves bioquímiques, s'utilitza per a la identificació de bacils de la família Enterobacteriaceae.
El medi es sembra amb un ansa recta o agulla, es realitzen una o dues puncions fins al fons de l'tub, i després s'estria la superfície de l'mitjà en ziga-zaga.
Es incuba per 24 hores a 35-37 ° C a aerobiosi. Si cal es deixa incubant per 24 hores més.
És principalment útil per diferenciar espècies de Citrobacter lactosa negatius de Salmonel·les sp.
Font: Köneman I, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnòstic Microbiològic. 5ta ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
referències
- Mac Faddin J. (2003). Proves bioquímiques per a la identificació de bacteris d'importància clínica. 3era ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnòstic Microbiològic de Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
- Köneman I, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnòstic Microbiològic. 5ta ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
- Laboratoris Britània. Lisina ferro agar. 2015. Disponible a: britanialab.com
- Laboratoris BD. BBL Lysine Iron Agar Slants. 2007. Disponible a: bd.com
- Laboratoris Valtek. Medi LIA 2009. Disponible a: andinamedica.com