AGAR COMPTE ESTÀNDARD: FONAMENT, PREPARACIÓ I USOS - BIOLOGIA - 2025

El agar compte estàndard és un mitjà de cultiu sòlid, no selectiu, dissenyat per a la quantificació de la càrrega microbiana aeròbia present en mostres d'aigües de consum, aigües residuals, begudes làcties, entre d'altres aliments. A aquest mitjà també se li coneix com agar PCA, per les sigles en anglès Plate Count Agar. Va ser creat el 1953 per Buchbinder, Baris i Goldstein.

El mitjà agar compte estàndard està compost per extracte de llevat, tripteína, glucosa, agar i aigua destil·lada. Aquesta formulació conté elements bàsics nutricionals que permet el desenvolupament de la càrrega microbiana aeròbia present, no exigent.

Dilucions decimals per al comptatge de les UFC en agar compte estàndard. Font: Quentin Geissmann

Com el medi no conté inhibidors, els bacteris poden desenvolupar-se sense cap tipus de restriccions, per això és ideal per al recompte general de colònies. No obstant això, la tècnica de quantificació en placa no detectarà tots els bacteris presents, sinó només aquelles que siguin capaços de créixer sota les condicions ambientals a què sigui sotmès l'agar compte estàndard sembrat.

En aquest sentit, la tècnica de quantificació en placa busca determinar en general la quantitat de bacteris de l'tipus mesòfiles aeròbies, és a dir, aquelles que es desenvolupen en temperatures entre 25 i 40 ° C, amb una temperatura òptima de creixement a 37 ° C.

Aquest grup bacterià és molt important, perquè allà es troben la majoria dels bacteris patògens per a l'home.

Cal destacar que en ocasions pot interessar quantificar la quantitat de bacteris psicrófilas presents en els aliments. Aquests bacteris són aquelles que es desenvolupen a baixes temperatures (<20 ° C) i són les responsables que els aliments es descomponguin més ràpid, tot i estar a la nevera.

Així mateix, els bacteris termòfils, que es desenvolupen en un rang entre 50 ° C a 80 ° C o més, poden ser importants en certs tipus d'aliments com els enllaunats.

La quantificació microbiana s'expressa en unitats formadores de colònies (UFC) per gram o mil·lilitre de mostra.

fonament

El mitjà compte estàndard està dissenyat per permetre el desenvolupament satisfactori de les bacteris aerobis no exigents, ja que l'extracte de llevat, la tripteína i la glucosa proporcionen els nutrients necessaris per al bon desenvolupament microbià.

D'altra banda, el medi posseeix un color clar i un aspecte transparent, per això és ideal per a la visualització de les colònies desenvolupades pel mètode de sembrat en profunditat (abocament en placa).

També és possible el comptatge de colònies pel mètode de sembrat en superfície amb espàtula de Drigalski.

Quan la càrrega microbiana és alta, s'han de fer dilucions decimals de la mostra en estudi per poder realitzar el comptatge de les UFC.

Cal destacar que aquest mitjà és recomanat per l'American Public Health Association (APHA) per al recompte de mesòfils aerobis.

preparació

Pesar 23,5 gr de el medi deshidratat i dissoldre en un litre d'aigua destil·lada. Per dissoldre completament s'ha d'escalfar la mescla agitant freqüentment fins que bulli. Els passos sub-següents depenen de la tècnica de sembrat que es vagi a utilitzar.

Per a la tècnica d'abocament en placa

Distribuir dispensant de 12 a 15 ml en tubs d'assaig. Posteriorment, esterilitzar en autoclau a 121 ° C per 15 minuts. Deixar solidificar verticalment en forma de tac. Desar en nevera fins al seu ús.

Fondre el tac quan es vagi a utilitzar. Un cop fos mantenir-lo en bany de Maria a 44-47 ° C mentre es preparen les mostres.

Per sembrat en superfície

Esterilitzar el medi en autoclau a 121 ° C i posteriorment distribuir 20 ml en plaques de Petri estèrils. Deixar solidificar, invertir i guardar a la nevera fins al seu ús.

Temperar les plaques abans d'utilitzar. El pH de l'mig ha de quedar en 7,0 ± 0,2.

ús

L'agar compte estàndard s'usa en la tècnica de recompte de mesòfils aerobis durant l'anàlisi microbiològica d'aigua i aliments. El comptatge dels mesòfils aerobis cal, ja que determina la qualitat sanitària de la mostra en estudi.

L'aplicació d'aquesta tècnica (utilitzant aquest mitjà) permet la visualització macroscòpica de colònies aïllades per a la seva quantificació.

Tècnica d'abocament en placa (sembrat per profunditat)

-Procediment

La tècnica consisteix en el següent:

1) Homogeneïtzar la mostra per tal de redistribuir els bacteris presents.

2) Es realitza una suspensió inicial en un flascó o bossa estèril, respectant la relació 10 g o 10 ml de mostra en 90 ml de diluent (10 ^-1).

3) A partir de la suspensió inicial es realitzen les dilucions decimals pertinents depenent el tipus de mostra. Ex: (10 ^-2, 10 ^-3, 10 ^-4). Les dilucions es realitzen amb aigua peptonada o solució amortidora de fosfats.

Per a això es pren 1 ml de la suspensió inicial i es col·loca en 9 ml de diluent, continuar les dilucions si cal prenent ara 1 ml de la dilució 10 ^-2 i així successivament.

4) Es pren 1 ml de cada dilució i es col·loquen en plaques de Petri estèrils buides.

5) Afegir a cada placa 12 a 15 ml d'agar compte estàndard prèviament fos i reposat a 44 - 47 ° C.

6) Donar moviments rotatoris suaus a les plaques per distribuir la mostra al costat de l'agar uniformement i deixar solidificar.

7) Invertir les plaques i incubar a 37 ° C a aerobiosi per 24 a 48 hores.

8) Culminat el temps es procedeix a examinar les plaques ia comptar les colònies en la dilució que així ho permeti. Es tria per al comptatge aquelles plaques que tinguin entre 30 a 300 UFC.

El comptatge es pot fer manual o es pot fer ús de l'equip comptador de colònia.

Els valors permesos per ml de mostra poden variar d'un país a un altre segons les normes per les quals es regeixin.

-Càlcul de les UFC

El càlcul general es realitza utilitzant la següent fórmula:

Fórmula per al càlcul general de la quantificació de les UFC. Font: Administració Nacional de Medicaments Aliments i Tecnologia mèdica (ANMAT). Anàlisi microbiològica dels aliments, metodologia analítica oficial, microorganismes indicadors. 2014 Volum 3. Disponible a: anmat.gov.ar

Expressar els resultats en 1 o 2 dígits, multiplicant per la base 10 adequada. Exemple: si el resultat és 16.545 s'arrodoneix basant-se el tercer dígit a 17.000 i s'ha d'expressar de la següent manera: 1,7 x 10 ⁴. Ara bé, si el resultat fos 16.436 s'arrodoneix a 16.000 i s'expressa 1.6 x 10 ⁴.

Tècnica sembrat en superfície

-Procediment

-Inocular amb 0,1 ml de la mostra directa si és líquida, suspensió inicial 10 ^-1 o de les dilucions consecutives 10 ^-2, 10 ^-3 etc, al centre d'una placa d'agar compte estàndard.

Distribuir uniformement la mostra amb espàtula de Drigalski o vareta de vidre en forma de L. Deixar reposar per 10 minuts.

-Invertir les plaques i incubar en aerobiosi a 37 ° C per 24 a 48 hores.

Procedir a comptar les colònies, triar aquelles plaques que es troben en un rang entre 20-250 UFC.

-Càlcul de les UFC

Per al càlcul s'aplica el factor de dilució, que és l'invers. Es arrodoneix el nombre a 2 dígits significatius (arrodonint segons el tercer dígit) i s'expressa en potència de base 10. Per exemple, si es compten 224 UFC en la mostra sense dilució (10 ^-1), es reporta 22 x 10 ¹ UFC, però si la xifra fos 225 es reporta 23 x 10 ¹ UFC.

Ara bé, si es compten 199 UFC en la dilució 10 ^-3, es reportarà 20 x 10 ⁴ UFC, però si es compten 153 UFC en la mateixa dilució es reportarà 15 x 10 ⁴ UFC.

Control de qualitat

El medi de cultiu compte estàndard pot ser avaluat utilitzant soques conegudes certificades, com ara: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Si el mitjà de cultiu està en òptimes condicions s'espera un creixement satisfactori en tots els casos, a excepció de L. fermentum que pot tenir un rendiment regular.

Per avaluar l'esterilitat de el mitjà de cultiu s'han de covar una o dues plaques de cada lot preparat (sense inocular) a 37 ° C a aerobiosi per 24 hores. A el cap d'aquest temps no s'ha d'observar cap tipus de creixement, ni canvi de color de l'mig.

limitacions

-No fondre l'agar més d'una vegada.

-El mitjà preparat pot durar fins a 3 mesos sempre que es mantingui en nevera i protegit de la llum.

-Aquest mitjà no és adequat per microorganismes exigents, ni anaerobis.

referències

1. Administració Nacional de Medicaments Aliments i Tecnologia mèdica (ANMAT). Anàlisi microbiològica dels aliments, metodologia analítica oficial, microorganismes indicadors. 2014 Volum 3. Disponible a: anmat.gov.ar
2. Laboratoris Difco Francisco Soria Melguizo, SA Plate Count Agar. 2009. Disponible a:
3. Laboratoris Conda Pronadisa. Agar per mètodes estàndard (PCA) segons APHA i ISO 4833. Disponible a: condalab.com
4. Laboratoris Britània. Recompte en placa agar. 2015. Disponible a: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B i Velázquez O. 2009. Tècniques per a l'Anàlisi Microbiològic d'Aliments. 2ª ed. Facultat de Química, UNAM. Mèxic. Disponible a: depa.fquim.unam