ADN RECOMBINANT: TÈCNICA, APLICACIONS I FONAMENTS - BIOLOGIA - 2024

El ADN recombinant (ADNr o rDNA) és una molècula artificial d'àcid nucleic creada al laboratori, mitjançant la integració de segments d'interès de dos organismes. També és conegut com a ADN quimèric, gràcies a la seva propietat híbrida. Aquest tipus d'ADN no el trobem a la natura.

La metodologia bàsica per generar-inclou: (a) la selecció d'un ADN blanc, i la seva inserció en un altre fragment d'ADN (generalment un plasmidi bacterià); (B) la introducció d'aquest plasmidi en un bacteri, (c) la selecció dels bacteris per mitjà d'antibiòtics i finalment (d) l'expressió de el gen.

Font: pixabay.com

La tècnica treu profit d'un joc d'enzims que permeten copiar i enganxar fragments específics d'ADN segons el parer de l'investigador.

L'objectiu de la tecnologia recombinant és, en la majoria dels casos, l'expressió d'una proteïna (coneguda com a proteïna recombinant) desitjada pel biòleg molecular per a futures investigacions o per crear una proteïna de valor comercial i terapèutic - com la insulina humana, per exemple.

Fonaments de la tècnica de l'ADN recombinant i la seva utilització en l'enginyeria genètica

El dogma central de la biologia molecular

Tots els éssers orgànics que coneixem comparteixen diverses característiques. Una d'elles és la naturalesa de l'material genètic i la manera en què es produeixen les proteïnes - procés conegut com el "dogma" central de la biologia molecular.

Amb excepció d'una parell de virus, tots els organismes emmagatzemen la informació genètica en l'ADN (àcid desoxiribonucleic), recollit de manera molt compacta i organitzada en el nucli de la cèl·lula.

Per a l'expressió dels gens, la molècula d'ADN és transcrita a l'ARN missatger, i aquest últim és traduït a l'llenguatge d'aminoàcids, els blocs estructurals de les proteïnes.

En què consisteix un ADN recombinant?

Entre les dècades dels 70 i els 80, els biòlegs moleculars van començar a treure profit dels processos que naturalment tenen lloc a l'interior de la cèl·lula i van aconseguir extrapolar-los a laboratori.

D'aquesta manera, un gen d'origen animal (un vertebrat, per exemple) podia ser inserit en un segment d'ADN provinent d'un bacteri; o bé l'ADN d'un bacteri podia ser combinat amb un ADN viral. Així, podem definir a un ADN recombinant com una molècula composta per ADN provinent de dos organismes diferents.

Una vegada que s'ha creat aquesta molècula híbrida o recombinant, es procedeix a l'expressió d'el gen d'interès. Amb la paraula expressió volem fer referència a el procés de traducció a proteïna.

Enzims de restricció i lligases: la clau per al procés

Un element clau per poder desenvolupar la tecnologia d'ADN recombinant va ser el descobriment dels enzims de restricció.

Aquestes són molècules proteiques que exhibeixen la capacitat d'escindir a l'ADN (nucleases) en seqüències concretes, servint com unes "tisores moleculars". Els fragments generats per aquests enzims s'anomenen fragments de restricció.

Aquestes enzims poden produir en la seqüència blanc talls simètrics (en ambdues cadenes a la mateixa alçada) o talls asimètrics. Un aspecte clau de l'acció dels enzims de restricció és que posterior a l'escissió de les cadenes s'obté un "vora solt", complementari a l'altra vora tallat pel mateix enzim.

Alguns exemples són ECOR 1 i Sma 1. Actualment es coneixen més de 200 tipus d'enzims de restricció i estan disponibles comercialment.

Per ser d'utilitat, unes tisores ha de venir acompanyada de la cola. Aquesta acció de segellat de l'ADN (prèviament tractat amb enzims de restricció) és portada a terme per les ligases.

Tècnica: com es modifica de manera artificial l'ADN d'un organisme en laboratori?

A continuació descriurem els passos principals que requereix la tecnologia d'ADN recombinant. Tots són duts a terme per professionals en un laboratori de biologia molecular.

Què és un "clon"?

Abans de continuar amb el protocol experimental, hem de fitar que en biologia molecular i biotecnologia és àmpliament usat el terme "clon" i el verb "clonar". Això podria portar a confusió.

En aquest context, no ens referim a la clonació de tot un organisme (com en el cas de la famosa ovella Dolly, per exemple), sinó a la clonació d'un fragment d'ADN, que pot ser un gen. És a dir, produir moltes còpies - genèticament idèntiques - de la seqüència.

1. Aïllament i obtenció de l'ADN

El primer pas és decidir quina seqüència desitja ser utilitzada. Això depèn totalment de l'investigador i dels objectius del seu treball. Després, s'ha d'aïllar i purificar aquest ADN. Els mètodes i procediments per aconseguir-depenen al seu torn de l'organisme i de la roba.

Generalment es pren una porció de teixit i se sotmet a un tractament en un tampó de lisi amb proteïnasa K (un enzim proteolítica) i després s'extreu l'ADN. Posteriorment, es procedeix a la fragmentació de l'material genètic en petits fragments.

2. Vector de clonació

Després dels passos preparatoris, l'investigador busca introduir el segment d'ADN d'interès en un vector de clonació. D'ara en endavant a aquest segment d'ADN l'anomenarem ADN blanc.

plàsmids

Un dels vectors més usats en un plasmidi d'origen bacterià. Un plasmidi és una molècula d'ADN circular de doble cadena que trobem de manera natural en els bacteris. Són ens aliens a l'cromosoma bacterià - és a dir, són extracromosomales, i es troben de manera natural en aquests procariotes.

Els elements bàsics d'un vector són: (a) un origen de replicació, que permet la síntesi d'ADN; (B) agent de selecció, que permet identificar els organismes que porten el plasmidi amb l'ADN blanc, com la resistència a algun antibiòtic; i (c) lloc de multiclonación, on es troben les seqüències que seran reconegudes pels enzims de restricció.

El primer ADN recombinant reeixit en el laboratori va ser clonat en el plasmidi pSC101 provinent del bacteri E. coli. Aquest conté un lloc de restricció per l'enzim de restricció EcoRI i un gen de resistència a un antibiòtic, a més de l'origen de l'replicació.

La inserció de l'ADN blanc al plasmidi es realitza utilitzant les eines moleculars d'enzims de restricció i lligases descrites en l'apartat anterior.

Tipus de vectors restants

A més dels plasmidis, l'ADN pot ser inserit en un altre vector, com el bacteriòfag lambda, els còsmids, els YAC (cromosomes artificials de llevat), els BAC (cromosoma artificial bacterià) i els fagèmids.

3. Introducció de l'ADN recombinant

Una vegada que s'ha obtingut la molècula d'ADN recombinant (gen d'interès en el plasmidi o un altre vector) aquesta s'introdueix en un organisme amfitrió o hoste, que pot ser un bacteri.

Per introduir ADN forà en un bacteri s'usa una tècnica anomenada transformació bacteriana, on se sotmet a l'organisme a un tractament amb cations divalents que el fa susceptible a la presa d'ADN.

Metodològicament, no podem assegurar que el 100% dels bacteris en el nostre cultiu han pres de manera efectiva la nostra molècula d'ADN recombinant. És aquí on entra en joc la porció de l'plasmidi que conté la resistència a l'antibiòtic.

Així, els bacteris que han pres el plasmidi seran resistents a cert antibiòtic. Per seleccionar-les, n'hi haurà prou l'aplicació d'aquest antibiòtic i prendre les supervivents.

4. "Collir" la proteïna

Després de seleccionar els bacteris amb el nostre ADN recombinant, procedim a fer servir la maquinària enzimàtica de l'hoste per generar el producte proteic d'interès. A mesura que els bacteris es van reproduint, el plasmidi passa a la seva descendència, així que no es perd durant la divisió.

Aquest procediment fa servir al bacteri com una mena de "fàbrica" ​​de proteïnes. Més endavant veurem que ha estat un procediment molt rellevant en el desenvolupament de tractaments mèdics efectius.

Una vegada que el cultiu està llest i els bacteris s'han produït grans quantitats de proteïnes, es procedeix a la lisi o trencament de la cèl·lula. Hi ha una àmplia gamma de tècniques bioquímiques que permeten la purificació de proteïnes d'acord amb les seves característiques fisicoquímiques.

En un altre context experimental pot ser que no ens interessi generar la proteïna, sinó que ens interessa obtenir la seqüència d'ADN per se. Si fos el cas, el plasmidi serviria per a la creació de múltiples còpies de el fragment que ens interessa amb l'objectiu de tenir quantitat suficient de l'ADN blanc per realitzar els experiments pertinents.

aplicacions

La tecnologia d'ADN recombinant va obrir un nombre infinit de possibilitats a la biologia molecular, biotecnologia, medicina i altres àrees relacionades. Les seves aplicacions més resaltantes són les següents.

anàlisi genètica

La primera aplicació està directament relacionada amb els laboratoris de biologia molecular. La tecnologia d'ADN recombinant permet als investigadors entendre la funció normal dels gens, i les proteïnes generades poden ser usades en investigacions posteriors.

indústria farmacèutica

Les proteïnes produïdes usant el procediment d'ADN recombinant tenen aplicacions en la medicina. Dos exemples molt rellevants en el camp són la insulina humana i l'hormona de creixement, que s'aplica en pacients que no tenen aquesta proteïna.

Gràcies a l'ADN recombinant es poden generar aquestes proteïnes sense necessitat de extreure-d'un altre ésser humà, la qual cosa representa complicacions metodològiques addicionals i riscos per a la salut. Això ha ajudat a millorar la qualitat de vida d'innombrables pacients.

referències

1. Baca, LEL, & Álvarez, CLC (2015). Biologia 2. Grup Editorial Pàtria.
2. Cooper, GM, Hausman, RE, & Hausman, RE (2000). The cell: a molecular approach (Vol. 10). Washington, DC: ASM press.
3. Devlin, TM (2004). Bioquímica: llibre de text amb aplicacions clíniques. Reverté.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). Rol dels Recombinant DNA Technology to Improve Life. International journal of genomics, 2016, 2.405.954.
5. Mindán, FP, & Mindan, P. (1996). Anatomia patològica. Elsevier Espanya.
6. Tortora, GJ, Funke, BR, & Casi, CL (2007). Introducció a la microbiologia. Ed. Mèdica Panamericana.
7. The, MJ (1989). Human insulin: DNA technology 's first drug. American Journal of Health-System Pharmacy, 46 (11_suppl), S9-S11.