- Unitat de l'activitat enzimàtica
- activitat específica
- Com es mesura l'activitat enzimàtica?
- -Mètode colorimètric
- forma contínua
- forma discontínua
- -Mètode de lectures a la llum ultraviolada
- Regulació de l'activitat enzimàtica
- Control a nivell de el substrat o del producte
- Control per retroacció
- enzims al·lostèrics
- Homoalosterismo
- Heterolosterismo
- Factors que influeixen en l'activitat enzimàtica
- Concentració de el substrat
- -pH de la reacció enzimàtica
- Temperatura de la reacció enzimàtica
- Concentració iònica de la reacció
- referències
L' activitat enzimàtica és una manera d'expressar la quantitat de l'enzim present en un moment determinat. Indica la quantitat de substrat transformat en producte, per l'acció catalítica de l'enzim per unitat de temps.
És influenciada per les condicions en què té lloc la reacció enzimàtica, raó per la qual se sol referir a la temperatura a la qual es mesura. Però, què són els enzims? Són catalitzadors biològics, capaços d'accelerar la velocitat d'una reacció sense experimentar un canvi irreversible durant el procés catalitzat.
Pinya o ananàs, fruita que conté l'enzim bromelina, i que per tant exhibeix una alta activitat enzimàtica.Fuente: H. Zell
Els enzims, en general, són proteïnes amb l'excepció dels ribosomes, molècules de RNA amb activitat enzimàtica.
Els enzims incrementen la velocitat de la reacció mitjançant la reducció de la barrera energètica (energia d'activació); que ha de vèncer per assolir l'estat de transició i passi així la reacció.
Les molècules de l'substrat que aconsegueixen l'estat de transició experimenten canvis estructurals, que les porten a originar les molècules del producte. Amb base a les funcions que compleixen, els enzims es classifiquen en sis grans grups: oxirreductasas, transferases, hidrolases, liases, isomerasas i ligases.
Els enzims bromelina i papaïna, per exemple, són enzims proteolítics (hidrolases) que es troben a la pinya o ananá, ia la papaia o lletosa, respectivament.
És conegut que tant la pinya com la papaia, faciliten el procés digestiu, ja que a l'actuar els enzims proteolítics que contenen ajuden a digerir les proteïnes provinents de, a dir, les carns i grans.
Unitat de l'activitat enzimàtica
La unitat enzimàtica (UI) és la quantitat d'enzim que catalitza la transformació d'1 mmol de substrat en un minut.
Posteriorment, el Sistema Internacional d'Unitats (SI) va definir la unitat d'activitat enzimàtica com la quantitat d'enzim que converteix 1 mol de substrat en producte per segon. Aquesta unitat va rebre el nom de katal (kat).
1 mol = 10 6 μmoles i 1 minut = 60 segons.
Per tant, 1 katal equival a 60 · 10 6 UI. Com el katal és una unitat gran, se solen utilitzar unitats menors, com: el microkatal (μkat), 10 -6 katal, i el nanokatal (πkat), 10 -9 katal.
activitat específica
És el nombre de les unitats d'activitat enzimàtica dividit entre els mil·ligrams de proteïna de la mostra sotmesa a assaig. L'activitat específica està relacionada en forma directa amb el grau de purificació de l'enzim.
Com es mesura l'activitat enzimàtica?
Hi ha diversos mètodes per determinar l'activitat d'un enzim. L'elecció d'un mètode en particular dependrà de l'objectiu de l'assaig enzimàtic; l'aplicabilitat de l'mètode; l'accés a l'equip necessari per realitzar l'experiment; el cost de la utilització d'un mètode determinat, etc.
Existeixen mètodes espectrofométricos, fluorométricos, de quimioluminiscència, calorimètrics, radiomètrics i cromatogràfics.
Els mètodes espectrofotomètrics poden ser colorimètrics i lectures a la regió de la llum ultraviolada (UV) de la radiació electromagnètica.
-Mètode colorimètric
Es basa en la generació d'un cromòfor per l'acció enzimàtica. L'activitat enzimàtica pot ser seguida en forma contínua o discontínua.
forma contínua
En la forma contínua es col·loquen els reactius en una cubeta en l'espectrofotòmetre a la longitud d'ona desitjada, la qual correspon a aquella a el qual el cromòfor té el seu màxim valor de densitat òptica; i que a més, no hagi interferència amb una altra substància que pugui generar-se.
La reacció enzimàtica s'inicia per l'addicció de la mostra que conté l'enzim, l'activitat es vol determinar. Simultàniament, es posa a funcionar el cronòmetre, ja de tant en tant, s'anota el valor de densitat òptica.
Com es coneix l'equivalència de la densitat òptica amb els mols de substrat o del producte de l'acció enzimàtica, depenent de la tècnica utilitzada, es pot calcular els mols de el substrat consumits o dels mols produïts.
A més, com s'ha mesurat el temps transcorregut de la reacció enzimàtica, es pot obtenir els mols consumits o produïts per segon. Així, l'activitat enzimàtica s'estableix en unitats katal.
forma discontínua
En la forma discontínua de determinar l'activitat enzimàtica, es col·loquen els tubs d'assaig amb els components de la reacció, a excepció de la mostra que conté l'enzim o un altre component, en un bany a 37 ºC. La reacció s'inicia llavors amb l'addicció de el component que falta.
Es deixa que passi el temps que la tècnica indica, i la reacció és finalitzada per l'addicció d'un compost que deté la reacció. Es llegeix la densitat òptica en aquest moment, i es procedeix finalment de la mateixa manera que en la forma contínua per determinar l'activitat enzimàtica.
-Mètode de lectures a la llum ultraviolada
El coenzim nicotinamidadinucleótido, per exemple, té dues formes: NADH (reduïda), i NAD + (rovellada). Així mateix, el coenzim nicotinamidadinucleótidofosfato té dues formes NADPH i NADP +, reduïda i oxidada, respectivament.
Tant les formes reduïdes com oxidades del coenzim, es llegeixen a una longitud de 260 nm de la llum ultraviolada; mentre, només les formes reduïdes es llegeixen a una longitud de 340 nm de la llum ultraviolada.
Per tant, tant en les reaccions d'oxidació o reducció en les quals intervenen les coenzims nomenades, es llegeixen a 340 nm.
La determinació de l'activitat enzimàtica, en essència, és el mateix que el seguit en la forma contínua de l'mètode colorimètric; llevat, que es llegeix la densitat òptica a 340 nm per observar la generació de NADH o NADPH, o per mesurar el consum d'aquestes coenzims.
Això va dependre si la reacció mesura és d'oxidació o de reducció. Mitjançant la correspondència entre la densitat òptica i els mols de NADH i NADPH, segons sigui el cas, es pot calcular l'activitat enzimàtica dividint els mols del coenzim entre el temps transcorregut en segons.
Regulació de l'activitat enzimàtica
Control a nivell de el substrat o del producte
A mesura que augmenta la concentració de l'substrat, augmenta l'activitat enzimàtica. Però a una concentració determinada d'el substrat, es satura el lloc actiu o els llocs actius de l'enzim, de manera que l'activitat enzimàtica es fa constant.
No obstant això, el producte de l'acció enzimàtica també pot interaccionar amb els llocs actius de l'enzim, produint una inhibició de l'activitat enzimàtica.
El producte pot actuar com un inhibidor competitiu; per exemple, pot esmentar l'enzim hexoquinasa. Aquest enzim produeix la fosforilació de la glucosa originant la glucosa-6-fosfat, compost que a l'acumular-inhibeix a l'hexoquinasa.
Control per retroacció
Pot passar que un grup d'enzims (A, B, C, D, E i F) actuïn en forma seqüencial en una via metabòlica. L'enzim B fa servir com a substrat el producte de l'enzim A, i així successivament.
La cèl·lula, depenent dels seus requeriments metabòlics, pot activar o inhibir les seqüències d'activitats enzimàtiques. Per exemple, l'acumulació del producte de l'enzim F, pot actuar inhibint l'enzim A o qualsevol altra dels enzims de la seqüència.
enzims al·lostèrics
Un enzim pot estar formada per diverses subunitats, cadascuna amb els seus respectius llocs actius. Però aquestes subunitats no actuen independentment, de manera que l'activitat d'una de les subunitats pot activar o inhibir l'acció de les restants.
Encara que l'hemoglobina no és considerada un enzim, és un magnífic model de el fenomen de Al·losterisme. L'hemoglobina està formada per quatre cadenes proteiques, dues cadenes α i dues cadenes β, cadascuna d'elles unides a un grup hemo.
Entre les subunitats pot ocórrer dos fenòmens: homoalosterismo i heteroalosterismo.
Homoalosterismo
La unió de l'substrat a una de les subunitats augmenta l'afinitat de les altres subunitats pel substrat, augmentant al seu torn l'activitat enzimàtica de cadascuna de les subunitats restants.
Així mateix, la inhibició de l'activitat enzimàtica en una de les subunitats, produeix el mateix efecte en les restants.
En el cas de l'hemoglobina, la unió de l'oxigen a un grup hemo d'una de les cadenes de la proteïna, provocarà un augment de l'avidesa per l'oxigen en les restants cadenes.
Així mateix, l'alliberament de l'oxigen d'un grup hemo, provoca l'alliberament d'oxigen dels restants grups de les cadenes proteiques.
Heterolosterismo
La unió d'una substància activadora o inhibidora, diferent de el substrat, a una de les subunitats provocarà una activació o inhibició de l'activitat enzimàtica en les altres subunitats.
En el cas de l'l'hemoglobina, la unió a el grup hemo de H +, CO 2 i 2,3-difosfoglicerat a una de les subunitats, disminueix l'afinitat de el grup hemo per l'oxigen, provocant el seu alliberament. Aquest alliberament d'oxigen també és produïda en les altres cadenes de l'hemoglobina.
Factors que influeixen en l'activitat enzimàtica
Concentració de el substrat
A mesura que augmenta la concentració de l'substrat, augmenta també l'activitat enzimàtica. Això es deu a un major accés de les molècules de l'substrat als llocs actius de l'enzim.
Però, per a una concentració determinada d'el substrat, es saturen d'aquest tots els llocs actius de l'enzim, provocant que l'activitat enzimàtica no augmenti fins i tot si s'incrementa la concentració de l'substrat.
-pH de la reacció enzimàtica
Els enzims tenen un pH òptim en el qual l'afinitat de l'enzim pel substrat és màxima. A aquest pH s'aconsegueix el màxim valor de l'activitat enzimàtica.
L'excés d'acidesa o basicitat de l'mig, pot provocar una desnaturalització de l'enzim, disminuint en conseqüència la seva activitat.
El perfil de pH de l'activitat enzimàtica és variat. Així per exemple, la pepsina té una activitat màxima entre 1-2 unitats de pH; la tripsina té un pH òptim de 8; i la papaïna té una activitat constant entre una gamma de pH compresa entre 4 i 8.
Temperatura de la reacció enzimàtica
L'activitat enzimàtica s'incrementa a mesura que augmenta la temperatura. En general, l'activitat enzimàtica es duplica per cada 10 graus d'increment, fins a aconseguir la temperatura òptima de l'activitat enzimàtica.
No obstant això, a l'superar la temperatura òptima, l'activitat enzimàtica tendeix a disminuir a mesura que s'incrementa la temperatura de la reacció. Això és degut al fet que les proteïnes, i per tant els enzims, pateixen una desnaturalització per un augment excessiu de la temperatura.
Concentració iònica de la reacció
En general, els enzims tenen una activitat òptima en una gamma de concentració, compresa entre 0 i 500 mmols / L. No obstant això, per a concentracions majors, l'activitat enzimàtica tendeix a disminuir.
Sota aquestes circumstàncies, es bloquegen certes interaccions iòniques en els enzims, necessàries per a la seva màxima activitat.
referències
- Segel, IH (1975). Biochemical Calculations. (2 nd Edition). John Wiley & Sons, INC
- Lehninger, A EL (1975). Bioquímica. (2 nd Edition). Worth Publishers, inc.
- Mathews, CK, van Holde, KE i Ahern, KG (2002). Bioquímica. (3 ra Edició). Pearson Addison Weshley.
- Wikipedia. (2019). Enzyme assay. Recuperat de: en.wikipedia.org
- González Juan Manuel. (Sf). Cinètica enzimàtica. Curs de biomolècules. Recuperat de: ehu.eus